特异性蛋白酶酶解虾副产物制备ACE抑制肽

左 琦，吴秉宇，张建华，钱炳俊

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

特异性蛋白酶酶解虾副产物制备ACE抑制肽

左 琦，吴秉宇，张建华*，钱炳俊

（上海交通大学农业与生物学院，上海200240）

ACE抑制肽构效关系（QSAR）的研究认为小肽C末端氨基酸的疏水性和其ACE抑制活性之间呈正相关关系。针对性地选择胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶两步酶解虾副产物制备ACE抑制肽。在一定温度、pH和加酶量条件下，以蛋白质的水解度和ACE抑制率为指标，确定胰凝乳蛋白酶、脯氨酸蛋白酶的最佳酶解时间均为4h。两步酶解产物ACE抑制的IC50值为1.645mg protein/mL。经透析后，得到0～500u（组分1）和500～1000u（组分2）两个组分，组分1和组分2的IC50值分别降为0.333mg peptide/mL和1.320mg peptide/mL。质谱分析结果表明组分1中含有10个肽，分别由5～14个氨基酸组成；组分2中含有15个肽，分别由7～14个氨基酸组成。25个已知序列多肽中有22个多肽的羧基端是脯氨酸或芳香族氨基酸，与预期相符。

α-胰凝乳蛋白酶，脯氨酸蛋白酶，虾副产物，ACE抑制肽

血管紧张素转换酶（ACE）在血压调节中有至关重要的作用，它能将没有活性的血管紧张素I（Asp-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）C末端的二肽裂解，使其转换为能促使血压升高的血管紧张素Ⅱ（Asp-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）[1]。因此，抑制ACE的活性将能降低血压。

ACE抑制肽构效关系（QSAR）的研究认为，ACE抑制肽的C端氨基酸是与ACE活性部位结合的关键，C末端氨基酸的疏水性和小肽的ACE抑制活性之间正相关[2]。C末端氨基酸为具环状结构的芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）或脯氨酸的ACE抑制肽，其活性一般较强[3]，如Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro[4]。

目前广泛用于治疗高血压的肽类药物，如卡托普利（Captopril）和赖诺普利（Lasinopril）都是C末端氨基酸为脯氨酸的肽，但都是化学合成品，虽然具有很好的降压效果，但是会引发皮肤病、咳嗽、肾功能衰竭等副作用[5]。近年来，有从乳清[6]、鱼[7]、鸡肉组织[8]和鸡蛋[8]等食物原料中分离得到ACE抑制肽的报道，寻找毒副作用小的食源性ACE抑制肽成为目前的研究热点。

我国虾类资源极为丰富，虾仁加工业比较发达，然而虾仁加工同时产生的大量虾头、虾壳等副产物却没有得到充分的利用[9]。虾副产物中蛋白质的比例较高，若能选用合适的酶对其进行酶解，制备ACE抑制肽，将能提高虾副产物的利用价值。本实验结合前期国内外对功能性寡肽构效关系（QSAR）的研究成果，选择α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶两种特异性蛋白酶酶解虾副产物，有望制备得到羧基端为脯氨酸或芳香族氨基酸的ACE抑制肽。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 上海海旭水产有限公司；α-胰凝乳蛋白酶 国药集团化学试剂有限公司；脯氨酸蛋白酶 帝斯曼（中国）有限公司；TNBS（三硝基苯磺酸）、血管紧张素转化酶（ACE）、底物（Hippuryl-His-Leu）、肽标准混合物（由Gly-Tyr、Val-Tyr-Val、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe组成） 美国Sigma公司；CE透析袋 上海新睿生物科技有限公司。

多功能粉碎机 上海正慧工贸有限公司；DK-8D三孔电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；恒温干燥箱 德国Binder有限公司；UVmini-1240分光光度计 日本岛津仪器有限公司；5415D离心机 德国Eppendorf公司；320 pH计 美国梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪 德国Bruke Dionex公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料准备 南美白对虾剥皮、去头，放于恒温干燥箱中65℃烘干12h，取出粉碎，过60目筛。

1.2.2 酶解条件 α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶的酶解条件[10-11]如表1所示。

表1 两种酶的酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions ofα-chymotrypsin and proline specific protease

1.2.3 蛋白质含量测定和氨基酸分析 称取1.0g样品，加入12mL硫酸和催化剂（硫酸铜和硫酸钾），放在FOSS消化炉上，消化1.5h。然后用自动凯氏定氮仪测定上清液的蛋白质含量[12]。氨基酸分析：氨基酸专用高效液相色谱法[13]。

1.2.4 水解度的测定 参考Adler-Nissen[14]的方法进行改进。在试管中加入2.00mL pH8.2的磷酸盐缓冲液和0.25mL样品混匀，再加入2.00mL 0.10%TNBS溶液摇匀，50℃水浴中避光反应60min后，加入4.00mL（0.10mol/L HCl）终止反应，室温冷却30min后，于340nm波长处测定吸光度。用不同浓度的亮氨酸代替样品做标准曲线。

水解度的计算：

式中：hNH2为反应后氨基态氮浓度（mmol/g）；h0为反应前氨基态氮浓度（mmol/g）；htot为每克原料蛋白的肽键毫摩尔数（mmol/g），虾壳蛋白htot＝8.073（mmol/g）。

1.2.5 ACE抑制率测定 参考Cushman[15]和Li-Chan[16]的方法进行改进。以Hippuryl-His-Leu为底物，测定抑制剂对ACE的抑制活性。试管中加入ACE（酶活力为0.86U/mL）和抑制剂各15μL，37℃水浴5min，然后加入HHL 75μL，37℃水浴45min后，加入1mol/L HCL终止反应。然后加入0.7mL乙酸乙酯萃取、离心（4000r/min，10min），吸取0.5mL乙酸乙酯层于试管中，120℃条件下使乙酸乙酯完全挥发，最后加入2mL去离子水，涡旋混匀后，228nm波长处测定其吸光值。ACE抑制率计算公式：

式中：C为ACE与HHL完全反应后的吸光度；A为加入抑制剂和ACE的吸光度；B为加灭活ACE的吸光度。

1.2.6 透析 首先将酶解液装入截留分子量为1000u的透析袋，放入装有去离子水的烧杯中；在磁力搅拌条件下透析6h后，换一次水，再透析4h；将烧杯里的溶液收集起来，得到分子量1000u以下的多肽溶液，45℃旋转蒸发浓缩后，装入截留分子量为500u的透析袋，最后透析得到分子量500～1000u的多肽溶液和分子量500u以下的多肽溶液，45℃旋转蒸发浓缩备用。

1.2.7 多肽含量测定 根据Church[17]的方法进行改进。首先配制50mL OPA溶液：分别加入25mL（100mmol/L）的四硼酸钠、2.5mL 20%（w/w）的十二烷基硫酸钠（SDS）、40mg的OPA（溶解在1mL甲醇中）；100μL的β-巯基乙醇，用去离子水定容至50mL。然后取50μL的酶解液与2mL的上述OPA溶液在室温下反应2min于340nm波长处测定吸光度。用不同浓度梯度的肽标准混合物代替酶解液做标准曲线。

1.2.8 质谱条件 负离子模式检测；检测范围为m/z 100～1000；毛细管电压为2800V；样品孔电压为20V；

MCP检测电压为2100V；喷雾气流量为50L/h；脱溶剂气流量为350L/h；脱溶剂温度为300℃；离子源温度为100℃；碰撞能量为25eV。

2 结果与讨论

2.1 虾副产物蛋白质含量及氨基酸组成分析

凯式定氮测得虾副产物蛋白质含量为59.94%± 0.98%，蛋白质含量较高，具备制备ACE抑制肽的基本条件。氨基酸分析结果（见表2）表明，虾副产物中，除去酸水解破坏的色氨酸外，脯氨酸和芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）占氨基酸总量的12.28%，从蛋白质含量和氨基酸组成两方面分析，虾副产物是制备ACE抑制肽好的来源。

表2 虾副产物氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of shrimp byproducts

2.2 α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶酶解时间的确定

α-胰凝乳蛋白酶为内切酶，可从酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基处切断肽键；脯氨酸特异性蛋白酶则能够在肽链中含有脯氨酸的羧基处切断肽键[10]。蛋白质的水解度代表蛋白质在酶解过程中，肽键被裂解的程度或百分比。根据两种蛋白酶酶解虾副产物的水解时间-水解度曲线确定两种酶的最佳酶解时间。

测定水解度的亮氨酸标准曲线如图1所示，胰凝乳蛋白酶的水解结果如图2所示。

一般认为，1个亮氨酸分子含有1个α-氨基，由此可将α-氨基的浓度转化为亮氨酸的浓度，在进行酶解液水解度测定时就可以根据图1得到酶解过程中产生的α-氨基，从而计算出相应的水解度。

图1 亮氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of Leucine

由图2可知，在0～30min之内，水解度的增加速率很快，这可能是在最初的30min内蛋白质中可断裂的肽键较多，水解度提高快，而随着时间的推移，酶可作用的肽键数目减少，水解速率下降，到4h水解度达到11%后，水解度保持不变，说明此时蛋白已经被完全水解。选择蛋白的水解终点，可以保证充分水解，便于后续分离得到小肽。因此，第一步酶解时间的确定，只需考虑水解充分性的因素，选择4h时间点。而第二步酶解时间的确定，则需要综合考虑酶解的充分性和ACE抑制率。

图2 虾副产物胰凝乳蛋白酶水解曲线Fig.2 Hydrolysis curve of shrimp byproduct by α-chymotrypsin

2.3 两步酶解产物ACE抑制活性的变化

脯氨酸蛋白酶的水解度和ACE抑制活性的变化如图3所示。

图3 脯氨酸蛋白酶水解度曲线和酶解液的ACE抑制活性Fig.3 Degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of proline specific proteases hydrolysate

由图3可知，在4h水解度达到4.74%以后，水解度保持不变，说明此时间点是脯氨酸蛋白酶的水解终点。脯氨酸蛋白酶酶解之后，进行ACE抑制活性测定。由图3可知，随着酶解时间的延长，ACE抑制率先上升，后下降，最后又上升。中间ACE抑制率的下降，可能是由于本来有抑制活性的大分子肽被酶解产生了无ACE抑制作用的小分子肽[18]。而随着酶解的进行，这些肽进一步被酶解成分子量更小的肽，其具有较高的ACE抑制率，当然，也有可能是肽浓度的增大，使ACE抑制率随之增大。根据结果得知，4h酶解时间的酶解液ACE抑制率最高，为61.30%，IC50为1.645mg/mL，选择此时间点的酶解液来进行后续实验。

2.4 透析后不同截留分子量透析液的ACE抑制活性

已有的研究结果表明，具有ACE抑制活性的肽，一般含有2～12个氨基酸，即分子量范围在256～1500u之间[19]。因此，选择截留分子质量1000u和500u的透析袋透析后，可以得到2个组分：组分1的分子质量小于500u，组分2的分子质量在500～1000u范围内。由于透析之后，去掉了分子量大于1000u以上的肽，所以要确定透析之后酶解液的肽浓度。测定肽浓度的标准曲线如图4所示。

图4 多肽标准曲线Fig.4 Standard curve of peptide mixture

图4中所指的肽标准混合物是由Gly-Tyr、Val-Tyr-Val、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe构成的混合物，这5个肽分别由2～8个氨基酸组成。用此混合物作为标准底测定透析液中的肽含量，可以比较精确的定量肽含量。标准曲线中，肽标准物浓度和吸光度值的相关系数R2=0.9994，线性相关性较强，可用公式y= 0.1887x-0.0001计算透析后透析液的肽浓度。

表3 透析产物和不同食物来源酶解肽的ACE抑制率IC50Table 3 ACE inhibitory peptides derived from different food proteins

由表3可知，未透析前，两步酶解产物的IC50值为1.645mg protein/mL，经过透析之后：组分1（0～500u）和组分2（500～1000u）的IC50值分别降为0.333mg peptide/ mL和1.320mg peptide/mL，可见透析分离后，IC50值有所下降。尤其是分子量为0～500u的肽，其IC50有较大程度的下降，表明经过透析，去掉了大分子的肽，得到分子量较小的肽，这些肽具有更高的ACE抑制活性。

由表3的对比可发现，虾副产物酶解液经过透析之后，分子量小于500u的透析液，其ACE抑制的IC50值低于以往研究中得到的食源性肽。说明虾副产物经过特异性蛋白酶的两步酶解，能制得ACE抑制率较高（IC50值低）的肽。

2.5 质谱分析结果

由表4可知，通过胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶两步酶解之后，组分1中含有10个肽，分别由5～14个氨基酸组成；组分2中含有15个肽，分别由7～14个氨基酸组成。25个已知序列多肽中只有EGGEL，VVIMTSHGNEQL，MSFQDSNNDGIGDL这3个多肽的羧基端不是脯氨酸或芳香族氨基酸，与文献[13]报道的ACE抑制性较强肽的羧基端应具有的结构相符合。

表4 两组分中多肽的组成Table 4 Composition of peptides in component 1 and 2

然而，得到的这22个羧基端是脯氨酸或芳香族氨基酸的肽，除了MIAMFMF、GKHLHTF、CYTEEVF这三个肽为7肽，其余19个肽都含有8个或8个以上的氨基酸。人体摄入之后，仍有可能被体内消化酶酶解。因此有必要模拟人体胃肠道消化，再对其进一步酶解。一方面考察这些肽经过消化酶酶解之后的活性变化，另一方面有望从中分离得到ACE抑制活性更高的肽。

3 结论

本文用胰凝乳蛋白酶—脯氨酸蛋白酶对虾副产物进行酶解，通过透析分离和质谱分析证实得到了一些C末端为芳香族氨基酸或脯氨酸的小分子肽，说明该酶解体系有望获得ACE抑制活性高的肽。但两步酶解的肽多为七肽以上，因此有必要模拟人体胃肠道消化，再对这些肽进一步酶解，一方面考察这些肽经过消化酶酶解之后的活性变化，另一方面有望从中分离得到ACE抑制活性更高的肽。

[1]Ghassem M，Arihara K，Babji A S，et al.Purification and identification of ACE inhibitory peptide from Harua（Channa striatus）myofibrillar protein hydrolysate using HPLC-ESI-TOF MS/MS[J].Food Chemistry，2011，129：1770-1777.

[2]Pripp A H，Isaksson T，Stepaniak L，et al.Quantitative structure-activity relationship modeling of ACE-inhibitory peptides derived from milk proteins[J].European Food Researchand Technology，2004，219：579-583.

[3]Cheung H S，Wang F L，Ondetti M A，et al.Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme.Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence [J].Journal of Biological Chemistry，1980，255：401-407.

[4]Foltz M，Cerstiaens A，Mols R，et al.The angiotensin converting enzyme inhibitory tripeptides Ile-Pro-Pro and Val-Pro-Pro show increasing permeabilities with increasing physiological relevance of absorption models[J].Peptides，2008，29：1312-1320.

[5]Israaili Z H，Hall W D.Cough and angioneurotic edema associated with angiotensin converting enzyme inhibitor therapy：A review of the literature and pathophysiology[J].Annals of Internal Medicine，1992，117（3）：234-242.

[6]Hernández Ledesma B，Recio I，Ramos M，et al.Preparation of ovine and caprine-lactoglobulin hydrolysates with ACE-inhibitory activity.Identification of active peptides from caprine β-lactoglobulin hydrolysed with thermolysin[J].International Dairy Journal，2002，12：805-812.

[7]Curis J M，Dennes D，Waddell D S，et al.Determination of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide Leu-Lys-Pro-Asn-Met（LKPNM）in bonito muscle hydrolysates by LC-MS/MS [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：3919-3925.

[8]Rao S Q，Ju T，Sun J，et al.Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic hydrolysate of hen egg white lysozyme[J].Food Research International，2012，46：127-134.

[9]王润莲，张政军，梁沛琼.虾、蟹、螺副产物的营养价值[J].饲料研究，2006：61-62.

[10]彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞，斯·蒂克尔，鲁波·伊第恩斯.来自Penicillium chrysogenum的脯氨酸特异性蛋白酶：中国，200980120102.4[P].2011-05-04.

[11]Kim S K，Wijesekara I.Developmentand biological activities of marine-derived bioactive peptides：A review[J]. Journal of Functional Foods，2010（2）：1-9.

[12]中华人民共和国卫生部.GB 5009.5-2010食品中蛋白质的测定[P].北京：中国标准出版社，2010.

[13]刘长虹.食品分析及实验[M].北京：化学工业出版社，2006：81-110，204-205.

[14]Adler Nissen J.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1979，27：1256-1262.

[15]Cushman D W，Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemistry Pharmacology，1971，20：1637-1648.

[16]Lo W M Y，Li-Chan E C Y.Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from in vitro pepsin-pancreatin digestion of soy protein[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53：3369-3376.

[17]Church F C，Swaisgood H E，Porter D H，et al. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J]. Journal of Dairy Science，1983，66：1219-1227.

[18]Theodore A E，Kristinsson H G.Angiotensin converting enzyme inhibition of fish protein hydrolysates prepared from alkaline-aided channel catfish protein isolate[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2007，87：2353-2357.

[19]Li G H，Le G W，Shi Y H，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J].Nutrition Research，2004，24：469-486.

[20]Kim S K，Byun H G，Park P J，et al.Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides purified from bovine skin gelatin hydrolysate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49：2992-2997.

[21]Jiang J L，Chen S W，Ren F Z.Milk casein as a functional ingredient：Preparation and identification of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides[J].JournalofDairy Research，2007，74：18-25.

[22]Fahmi A，Morimura S，Guob H C，et al.Production of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from sea bream scales[J].Process Biochemistry，2004，39：1195-1200.

[23]Jang J H，Jeong S C，Kim J H，et al.Characterization of a new antihypertensive angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from Pleurotus cornucopiae[J].Food Chemistry，2011，127：412-418.

Preparation of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from shrimp byproduct by specific enzyme hydrolysis method

ZUO Qi，WU Bing-yu，ZHANG Jian-hua*，QIAN Bing-jun
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

Based on the quantitative structure-activity relationship and predictive models of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptide，hydrophobic amino acid residues at C-terminal are positively correlated with ACE inhibitory activity.In order to get more proline and hydrophobic amino acid residues at C terminal，α-chymotrypsin and proline protease were chosen to hydrolyse the shrimp byproducts to produce ACE inhibitory peptides.The hydrolysis times were optimized according to the hydrolysis degree（HD）for α-chymotrypsin，and both HD and ACE-inhibitory activity for proline protease，the results showed that the optimal hydrolysis time for both enzyme were 4 hours.The half maximal inhibitory concentration（IC50）for ACE inhibition of hydrolysate was 1.645mg protein/mL.The hydrolysate was separated into fraction 1（0～500u）and fraction 2（500～1000u）by molecular weight cut-off（MWCO）membrane.The IC50value of fraction 1 and fraction 2 were 0.333mg peptide/mL and 1.320mg peptide/mL，respectively.The peptide mixtures were analyzed by time-of-flight mass spectrometry.Ten peptides，which were consisted of peptides with 5 to 14 amino acid residues，were identified in fraction 1.Fifteen peptides，which were consisted of peptides with 7 to 14 amino acid residues were identified in fraction 2.The C-terminal amino acids of 22 out of the 25 peptides were proline or aromatic amino acid，which was corresponding to QSAR results.

α-chymotrypsin；proline protease；shrimp byproducts；ACE inhibitory peptides

TS201.1

A

1002-0306（2014）10-0181-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.032

2013－09－02 *通讯联系人

左琦（1988-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。

国家海洋局海洋公益性行业科研专项经费项目（201205031-05）。