配合饲料、冰鲜杂鱼对大口黑鲈生长和LPL基因mRNA表达的影响

朱择敏，马冬梅，白俊杰，樊佳佳，廖国礼，梁旭方

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所 农业部热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室，广东 广州510380;2.暨南大学 生命科学技术学院生物工程学系，广东 广州510632)

大口黑鲈Micropterus salmoides 又名加州鲈，是一种原产于北美的广温性肉食性鱼类，目前，大口黑鲈的养殖主要靠投喂冰鲜杂鱼，开发适合的人工配合饲料已成为大口黑鲈养殖业的研究热点。喂食人工配合饲料的大口黑鲈肝脏易受到损伤［1］，因此，开展饲料中脂肪含量对鱼体生长、脂肪代谢及其基因表达影响的研究具有重要意义。

脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)的作用主要是催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，产生供机体组织利用的脂肪酸和单酰甘油［2-3］。大口黑鲈两种LPL 的全长cDNA 已得到克隆，并运用实时定量PCR 方法检测了脂蛋白脂肪酶mRNA 的组织分布，发现LPLtype1和LPLtype2均在肝脏中表达量最高，这可能与肝脏是最主要的营养诱导性贮脂部位有关［4］。

有关饲料中不同脂肪水平对大口黑鲈营养吸收、生长、肌肉组织成分、非特异性免疫，以及与生长相关的基因表达影响的研究已有报道［5-8］，但从分子水平分析饲料脂肪水平对大口黑鲈脂肪代谢的研究还很少。本研究中，不仅检测了不同脂肪水平饲料对大口黑鲈生长性能的影响，还从分子水平检测了对肝脏中两个脂蛋白脂肪酶基因mRNA表达量的影响，分析了饲料中的脂肪含量与生长及肝脏脂肪代谢基因的相互关系，旨在为研究大口黑鲈对外源脂肪的适应和调节能力提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鱼为中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地人工繁殖大口黑鲈，体质量约为40 g。

1.2 方法

1.2.1 人工配合饲料的制备 试验用冰鲜杂鱼为冰冻的蓝圆鲹Decapterus maruadsi，俗名池鱼。A、B 两种人工配合饲料的鱼油添加量分别为6%(质量分数，下同)和12%，面粉添加量分别为20%、14%，其余原料均为进口鱼粉42%、国产鱼粉10%、豆粕15%、复合维生素1%、复合矿物质4%、乌贼膏2%，将各原料充分混匀，用制粒机制成直径为4.5 mm 的颗粒饲料，制粒温度为40 ～45 ℃，自然风干，过筛后于-20 ℃下保存备用。经测定，A、B 两种配合饲料和冰鲜杂鱼的粗脂肪含量分别为8.2%、14.5%和4.4%，占各饲料干质量的8.9%、15.7%和12.3%(表1)。

表1 各组饲料营养组分Tab.1 Approximate composition of the test diets w/%

1.2.2 饲养管理 选择健康的大口黑鲈270 尾，随机分为3 组，每组设3 个重复，分别放入已消毒的水泥池(8 m3)中养殖，每池30 尾。3 组分别喂食冰鲜杂鱼、A 配合饲料和B 配合饲料。养殖条件相同，饲料用水均为充分曝气的自来水，每两天进行一次排污，测量水温和pH 值，并根据水质的具体情况换30% ～50%的曝气水，每日上、下午各投喂1次，少量投饵，喂食至鱼不再抢食为止，饲养试验共进行3 个月。试验过程中计算试验鱼的存活率，测量每组鱼的初始平均体质量(W0)和终末平均体质量(Wt)，并按下式计算［9-10］:

1.2.3 肝脏中两种LPL mRNA表达量的检测 饲养结束后，停食24 h。从对照组和试验组分别取6尾大口黑鲈，用MS222 麻醉，取其肝脏，用TRIzol(Invitrogen，USA)快速提取肝脏总RNA。以18S作为内参基因设计引物(表2)，用ABI 7300 型荧光定量PCR 仪检测大口黑鲈LPLtype1和LPLtype2 mRNA在各组大口黑鲈肝脏中的表达量。荧光定量所得数据，用2-△△CT法计算LPL 基因的相对表达量，用Excel 软件计算平均值和标准误。

表2 引物序列Tab.2 Primers in the study

1.3 数据处理

采用SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料脂肪水平对大口黑鲈生长的影响

从表3可见:喂食冰鲜杂鱼的对照组大口黑鲈的平均体质量增加率最大，为139.15%，与喂食B配合饲料和A 配合饲料的组存在显著性差异(P＜0.05)，喂食冰鲜杂鱼组的大口黑鲈生长速度明显快于喂食人工配合饲料的鱼。

表3 饲料脂肪水平对大口黑鲈存活率和生长速度的影响Tab.3 Effcets of dietary lipid levels on survival and growth rate of large mouthbass Micropterus salmoide

解剖各组大口黑鲈取其肝脏组织观察发现，喂食配合饲料的大口黑鲈肝脏出现不同程度的病变，表现为肝脏肿大，色泽变淡，外表无光泽，严重的鱼体内脾已为黑褐色。饲养过程中也发现，喂食配合饲料的大口黑鲈食欲不振，游动缓慢。

2.2 饲料脂肪水平对大口黑鲈肝脏中LPLtype1 mRNA、LPLtype2 mRNA表达量的影响

从图1可见，大口黑鲈肝脏中LPLtype1 mRNA与LPLtype2 mRNA 的表达相似，均为喂食高脂肪含量的B 配合饲料组鱼的肝脏中表达量最高，与喂食冰鲜杂鱼和A 配合饲料的组存在显著性差异(P＜0.05)(图1)。

图1 试验各组大口黑鲈肝脏中LPLtype1、LPLtype2 mRNA 的相对表达量Fig.1 The relative expression levels of large mouth bass LPLtype1，and LPLtype2 mRNA in livers of large mouthbass Micropterus salmoide in the experiment

3 讨论

本试验中，喂食冰鲜杂鱼的对照组大口黑鲈的平均体质量增加率明显高于喂食两种配合饲料的鱼，且喂食配合饲料的大口黑鲈肝脏出现不同程度的病变，表现出食欲不振，游动缓慢等现象，说明大口黑鲈这种肉食性养殖鱼类对人工配合饲料还没有形成很好的适应性。关胜军等［11］对大口黑鲈投喂人工配合软饲料和冰鲜杂鱼的生长对比试验结果也表明，从投喂第20天开始，喂食冰鲜杂鱼的大口黑鲈体质量显著高于喂食人工配合饲料的鱼，与本研究结果相似。冰鲜杂鱼中的粗脂肪含量占到了饲料干质量的12.3%，但由于其中各种脂肪和蛋白质所占的比例或其结合形式，易于被鱼类所吸收，所以不影响肉食性鱼类的健康生长。人工配合饲料虽然营养丰富，但与天然饵料相比其营养成分存在较大差异，而大口黑鲈对人工配合饲料还未形成很好的适应性，所以人工配合饲料影响了鱼体的健康生长，使其生长速度减慢。但也有学者认为，人工配合饲料对肉食性水产动物的生长没有显著影响［12-13］，这可能是由于养殖种类的不同，以及人工配合饲料适口性的差异和水产动物对人工配合饲料适应性的差异造成试验结果的不同。

大口黑鲈脂蛋白脂肪酶LPLtype1和LPLtype2基因在喂食配合饲料与喂食冰鲜杂鱼时相比，在肝脏出现了上调表达，且在喂食脂肪含量最高的B配合饲料组大口黑鲈肝脏中表达量最高，与喂食冰鲜杂鱼组和低脂肪饲料A 组有显著性差异，说明本研究中的两种人工配合饲料，特别是B 配合饲料中的脂肪含量已明显高于大口黑鲈对脂肪的需求量，而鱼体吸收的多余脂肪被贮存在鱼类最主要的营养诱导性贮脂部位肝脏中，脂蛋白脂肪酶是脂肪代谢的关键酶，在分解肝脏内多余的脂肪中起重要作用［14-15］，其表达受饲料中脂肪含量的调节。有研究表明，真鲷Pagrosomus major 的LPL 基因在肝脏也存在营养诱导性表达［16］，饥饿、高脂食物均是其表达诱导因子。杨奇慧等［17］也发现，喂食配合饲料的军曹鱼Rachycentron canadum 肝脏脂肪酶活性明显比喂食冰鲜鱼时高。Panserat等［18］采用cDNA Microarray 技术分析了用不同脂肪水平的饲料饲喂虹鳟Oncorhynchus mykiss 后其肝脏组织基因表达变化的情况，发现饲料脂肪水平诱导了虹蹲41 个肝脏基因的表达发生变化，其中包括脂蛋白脂肪酶基因的上调表达。

本试验中，喂食低脂肪和高脂肪配合饲料的试验鱼肝脏中LPLtype1 mRNA表达量分别是对照组鱼的1.3 倍和3.0 倍，而LPLtype2 mRNA表达量分别是对照组鱼的1.7 倍和3.0 倍。这说明LPLtype1与LPLtype2 两个基因具有相似的功能，且LPLtype2 基因对饲料中的脂肪含量更为敏感，更易受饲料中高脂肪含量的调节。氨基酸序列分析表明，大口黑鲈LPLtype1 与LPLtype2 之间的同源性为43.5%，LPLtype2 氨基酸序列比LPLtype1 少119个，主要表现为N 端部分序列缺失，但主要功能域仍保留着［4］。在大马哈鱼卵巢中也发现了两个LPL 基因，分别被命名为LPL1和LPL2，其氨基酸同源性仅为31%，在卵巢中，LPL1 mRNA表达量在4月份出现一个明显峰值，而LPL2 mRNA表达量在6月份出现一个明显峰值，推测脂蛋白脂肪酶基因也调节着卵巢成熟的季节变化发育，并可能存在一定的功能分工［19］。

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