虾夷马粪海胆NLR 家族基因片段的克隆及表达特征分析

陈亚东，刘晓飞，常亚青，仇雪梅，王秀利，刘洋

(大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)

NLR 家族(the nucleotide -binding domain and leucine-rich repeat containing gene family)属于模式识别受体［1-2］的重要一员，同源于植物抗病R蛋白，主要存在于细胞质内，识别进入细胞内的抗原物质，包括细菌组分、肽聚糖和核酸等［3］。目前已经有多种NLR 分子被发现，它们都具有保守的结构域:N 端可变区域、中间保守的NBD(nucleotide - binding domain)结构域和C 端的LRR(leucine-rich repeats)结构域。LRR 结构域的主要作用是识别包括细菌及真菌的一些细胞组分、病毒的核酸等［4-5］。N 端可变区域主要作用是和其他蛋白结合，传递接收到的抗原信号，是效应区，但有一些NLR 分子没有明显的N 端结构域［6］。N 端可变区域的不同变化对于NLR 蛋白激活不同后续免疫过程具有重要意义。NBD 结构域是NLR 分子多聚化所需要的结构。

根据N 端结构域的不同，NLR 家族可分为五类:NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX［7］。这些NLR 家族蛋白分子位于细胞质内，识别特异的微生物组分，最终激活NF-κB 信号通路，再调控表达IL -8、COX -2、IL -1β和抗菌肽等基因，进行免疫反应，以达到保护机体不受外来病原菌侵扰的目的［8］。紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus基因组内存在208 个NLR 家族基因，种类比人类NLR 家族(20种)丰富得多［9］。Hibino等［10］对紫球海胆的NLR 家族基因进行了聚类分析，并进一步划分出9 组亚类，也进行了初步的实时定量表达分析。虾夷马粪海胆与紫球海胆基因组具有高度的同源性，有关紫球海胆的NLR 家族基因的研究结果可为研究虾夷马粪海胆NLR 家族基因提供参考。

虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius 原产于日本北海道及以北沿海，在俄罗斯远东地区的萨哈林岛等地也有分布。大连海洋大学于1989年将其从日本引入中国，现已成为中国北方沿海特别是辽东和山东半岛重要的养殖种类，养殖规模越来越大。海胆作为一种模式生物已经被广泛应用于基础生物学研究。目前，对海胆生物学的研究主要集中在繁殖育苗［11-12］、饵料、疾病和营养等应用研究，也有关于细胞学［13］、分子标记［14-16］和功能基因克隆与分析［17-18］等基础研究，但对虾夷马粪海胆免疫系统分子水平的相关研究在国内尚未见报道。NLR 家族作为重要的免疫基因家族，其研究结果可以促进虾夷马粪海胆免疫系统分子机制的研究。本研究中克隆了虾夷马粪海胆NLR 家族基因编码区的保守序列，分析了核酸和氨基酸序列的多样性，采用半定量RT-PCR 技术检测了NLR 基因在不同组织中的表达，以期为研究虾夷马粪海胆天然免疫系统中NLR 分子功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用2 龄虾夷马粪海胆取自大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，海胆饲养于16 ～25 ℃的海水中，每日投喂新鲜海带。抽取体腔细胞前一日停止投喂。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的制备及cDNA 的合成 选取8 枚健康海胆(雌、雄各4 枚)，分别使用注射器抽取虾夷马粪海胆的体腔液，在4 ℃下以5000 r/min 离心10 min，收集体腔细胞，活体解剖虾夷马粪海胆，取其围口膜、肠、管足、雌雄性腺等组织，液氮冻存，于冰箱(-80 ℃)中保存备用。

按照EasyPureTMRNA Kit 试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)的方法提取各组织的总RNA，用凝胶电泳检测总RNA 的质量，-80 ℃下保存备用。为了减少个体差异及性别对试验结果的影响，各组织均使用4 枚海胆的RNA等量混合后用于反转录，其中精巢、卵巢各使用4 枚雄性或雌性海胆，其他组织均使用2 枚雌性和2 枚雄性海胆，混合后分别使用cDNA 第一链合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)合成cDNA 第一链。反转录产物于冰箱(-20 ℃)中保存，用于后续基因克隆及半定量分析。

1.2.2 引物设计 根据已报道的紫球海胆NLR 家族基因的编码区序列［10］，比对分析同一聚类的编码区的同源序列，根据保守区序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物11 对，用于NLR 基因部分序列的克隆和半定量RT -PCR 分析。除NLR5、NLR6和内参18S rRNA 引物为特异性引物外，其他为简并引物，其中，内参基因的引物根据Gen-Bank 中虾夷马粪海胆的18S rRNA 序列设计(Accession:D14365)。所有引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。

1.2.3 NLR 部分基因片段的扩增及回收测序 虾夷马粪海胆NLR 基因片段扩增的PCR 反应体系(50 μL):ddH2O 36.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL;10 × Taq buffer 5 μL;上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL;cDNA 模板2 μL;Taq 酶0.5 μL。PCR 反应程序:94 ℃下预变性5 min;94 ℃下变性30 s，退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共进行35 个循环;最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物质量。最后用凝胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)纯化回收目的条带，将纯化后的目的片段连接至PMD19 -T 载体中，然后将连接产物转化至DH5α 感受态细胞中，在附加氨苄青霉素、IPTG、X - gal 的LB 固体培养基中培养(37℃)12 ～16 h，挑取白色单菌落小量培养，使用PMD19 -T 通用引物进行菌液PCR 扩增，扩增体系和程序与上述相同，各选取10 个有目的基因插入的阳性单克隆菌液送样测序。

1.2.4 生物信息学分析 将测序结果使用BlastX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)软件进行比对，用NCBI 的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)搜索并预测蛋白的保守区域，按照正确的阅读框进行翻译，对氨基酸序列进行比对，由Clustal X 程序完成氨基酸序列多重比对分析。使用DNAStar 软件进行基因及氨基酸序列相似性的比对计算。

1.2.5 半定量RT-PCR 分析 对扩增得到基因片段进行比对，确认为虾夷马粪海胆中NLR 家族的基因后，使用表1 中引物，采用半定量RT -PCR法检测各组NLR 基因的表达情况。选取虾夷马粪海胆18S rRNA 作为内参基因。

根据预试验结果，PCR 扩增基因片段时基因及内参基因的引物都可以在55 ℃下获得较好的效果，因此，半定量的退火温度统一选用了55 ℃;预试验中，内参基因选取了18、19、20、21、22共5 个循环数，目的基因选取了26、28、30、32共4 个循环数，以求获得达到较好扩增效果时的循环数，最终发现，内参基因在18 个循环、目的基因在30 个循环数时扩增效果最好。

以根据内参基因调整浓度一致后的6种组织的cDNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 扩增程序:94℃下预变性5 min;94 ℃下变性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下再延伸1 min，进行18 或30 个循环;最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR 产物的质量。

表1 NLR 基因克隆引物Tab.1 Primers used for cloning of NLR genes

2 结果与分析

2.1 NLR 部分基因片段的克隆

经电泳检测获得了预期中的9 组NLR 基因聚类:NLR1、NLR3、NLR4、NLR5、NLR6、NLR7、NLR8.2、NLR8.3、NLR9。NLR2 组基因扩增未得到结果。为探索各组NLR 基因的序列多样性，本研究中各选取10 个单克隆进行测序，获得各组NLR 基因的部分序列。

2.2 虾夷马粪海胆NLR 基因部分序列的生物信息学分析

经过BlastX 比对发现:克隆得到9 组基因均含有NACHT和LRR and PYD domains-containing protein 类似蛋白，保守区域均为NACHT 结构;与紫球海胆NLR 基因的同源性最高，与设计引物所使用的模板基因均达到70%以上的序列相似度。将NLR 基因核酸序列按照正确的阅读框进行翻译，获得了编码的氨基酸序列，并使用Clustal X 1.8 软件对氨基酸序列进行序列比对，同时使用DNAStar软件分别进行核酸和氨基酸序列比对计算，相似性为100%。

对测序结果分析发现，NLR4、NLR6、NLR8.3、NLR9.1 组基因在10 个测序结果中存在完全一致的序列，其余5 组NLR 基因未出现完全一致的序列。同组内的NLR 基因序列也存在核酸和氨基酸序列长度和组成差异，其中NLR7 组基因的多样性最高，10 个测序结果中存在8种不同的序列长度，其次为NLR8.2 及NLR5 组，分别存在5种和4种不同长度的序列，其余NLR 基因组存在2 ～3种不同长度的序列(表2)。

此外，通过Clustal X 序列比对发现，同一聚类的氨基酸序列存在多种差异，存在序列变化最多的是NLR7 组，有些序列存在较长的氨基酸序列缺失，如NLR7 -6在160 ～190 号氨基酸之间比其他序列缺失22 个氨基酸(图1)。其余组的NLR 基因也都存在类似的差异。本试验中总共获得了有差异的NLR 家族基因序列80 条，可以看出，NLR 家族存在许多成员，尤其以NLR7 组的基因序列差异最大。

表2 NLR 基因cDNA 及氨基酸序列多样性分析Tab.2 Analysis of diversity and amino acid sequence of NLR cDNA

图1 采用Clustal X 1.8 软件对NLR7 组氨基酸序列的比对结果Fig.1 Alignment of deduced amino-acid sequences of NLR7 by Clustal X 1.8

2.3 半定量RT-PCR 分析

提取虾夷马粪海胆体腔细胞、围口膜、肠、管足、雄性性腺、雌性性腺组织的总RNA，反转录后在扩增效果好的循环数及退火温度下对NLR 家族基因进行半定量RT -PCR 分析，PCR 产物经电泳检测可看出，不同分组的NLR 基因在不同组织中的表达情况表现出差异(图2)。

从不同组织的扩增结果可以看出，NLR 基因在6种组织中均有扩增，从产物浓度来看，除NLR9 组在雄性性腺及肠中表达量最高并与其他组织存在明显差异外，其余基因在6种组织中的表达量未见有明显差异。NLR3 组整体表达量较低，仅在精巢中表达量达到一定水平，在其余组织中的表达量微弱。NLR 家族各基因在围口膜、性腺、肠中均有较高水平表达，在体腔细胞和管足中表达水平也较高，各家族间基因表达量存在部分差异，但未有较大浮动(图2)。

总体看来，NLR1、NLR3、NLR4 组基因处于较 低 的表达 水 平，而 NLR5、NLR6、NLR7、NLR8.2、NLR8.3、NLR9.1 组基因处于较高的表达水平，比较基因家族序列结果来看，基因和氨基酸序列差异越大的基因家族聚类，在各种组织中的表达量就越高。对比不同家族的表达量发现，序列差异最大的家族聚类NLR7、NLR8.2，表达量都处于较高水平。这可能与这两组基因的功能相关，推测这两组基因在虾夷马粪海胆的免疫反应中起着重要的作用。

3 讨论

NLR 家族作为重要的固有免疫体系中的一员，表达的多样性极大地影响虾夷马粪海胆抗病力的强弱，其他物种中也存在着较多的NLR 分子，Huang等［19］研究发现，文昌鱼基因组中有118 个NLR 分子。紫球海胆基因组测序完成后，通过基因预测发现，其存在208 个NLR 家族基因，种类比人类NLR 家族(20种)丰富得多［9］。通过对这3种物种的对比发现，越是低等的物种中NLR 基因家族越丰富，NLR 基因在低等动物的免疫反应中起着重要的作用。研究NLR 家族基因可以有效了解低等动物体内的免疫反应基本机制。本研究中，利用设计的NLR 引物进行PCR 扩增获得了虾夷马粪海胆的9 组NLR 家族聚类基因片段，证明了NLR 家族基因在虾夷马粪海胆各组织中都存在表达，而且通过对同一组基因的大量测序结果比对分析发现，每一个聚类都存在多个成员，在cDNA 长度上、基因序列上都存在差异。翻译后的氨基酸序列同样存在长度和氨基酸序列的变化。本研究中，共克隆出80 条虾夷马粪海胆NLR 家族基因的部分序列，并且具有序列差异，可以看出，NLR 家族基因的多样性极高。NLR是细胞内的模式识别受体，主要功能是识别外来抗原，正是因为NLR 家族基因具有如此的多样性，才能够满足类别多样的抗原识别要求。

图2 虾夷马粪海胆NLR 基因在不同组织中表达的RT-PCR 分析Fig.2 Expression of NLRs in tissues of sea urch Strongylocentrotus intermedius using RT-PCR

从半定量RT-PCR 检测结果来看，NLR 基因作为重要的免疫基因，在虾夷马粪海胆各组织中都存在表达，在不同组织中都处于高效表达的状态，但表达量存在些许差异。肠道及性腺表达量普遍较高，这符合已有研究中发现的NLR 家族在肠道中的表达量最高的结果［6］。

结合测序结果及半定量分析结果分析发现，同一NLR 家族聚类在DNA 序列及氨基酸序列上均存在差异，有些组差异较大，而且序列差异越大表达量就越高，这对于海胆免疫外界病原体的入侵以及对入侵后病原体的及时处理可能起着至关重要的作用。海胆体内只存在先天性免疫系统抵抗外界侵扰，成年海胆体腔内的体腔细胞主要承担对外界病原侵扰的免疫应答反应，并通过对外来物质的吞噬和封装功能来实现。海胆体腔内含有多种体腔细胞，各自发挥不同的免疫功能［20-21］。本研究中，肠及围口膜的高效表达可能与长期接触外来病原体有关。本研究中获得了虾夷马粪海胆的部分NLR家族基因序列，并对其不同组织的表达多样性进行了研究，为后续NLR 基因作用机制的探究及优良抗病海胆家系的筛选奠定了基础。

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