多子小瓜虫HSP70 基因ORF 的克隆及表达分析

夏润林，潘厚军，赵飞，方翔，石存斌，李华，吴淑勤

(1.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连116023;2.中国水产科学研究院珠江水产研究所 农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州510380)

多子小瓜虫Ichthyophthirius multifiliis是一种能感染淡水鱼类的重要纤毛虫，主要寄生于鱼的体表和鳃，引起“白点病”，对鱼的种类及年龄均无严格选择性，分布很广，在世界范围内能引起养殖鱼类大量死亡，在水产养殖和观赏鱼贸易中可造成重大经济损失［1-3］。多子小瓜虫的生活史分成感染性幼虫、寄生的滋养体和繁殖的包囊三个阶段［4］，其幼虫阶段和包囊阶段都是在水体中完成，因此，水温是其生存和繁衍后代最重要的因素之一。水温的变化对多子小瓜虫的包囊孵化［5］、幼虫活力［5］、感染率［6］和繁殖率［7］都有一定的影响。多数研究者［8-11］认为，小瓜虫病适宜发生的水温为15 ～25℃，当水温在30 ℃左右时，多子小瓜虫包囊的存活率仅约10%，而且包囊都不能孵化［5］，因而在多子小瓜虫的防控实践中，有将水温调高到28 ℃以上防治小瓜虫的报道［12-14］。也有研究者发现，水温在26 ～29 ℃时，小瓜虫病依然发生，并能感染淡水鱼［15］。笔者最近在养殖的过程中亦发现，在30 ℃左右水温时多子小瓜虫仍能大量感染草鱼。因此，揭示在高温环境中多子小瓜虫感染和存活的生理机制成为寄生虫防治中迫切需要解决的问题。张其中等［5］研究表明，水温在4 ℃左右或28 ～32℃时，多子小瓜虫都不能孵化，但有少部分虫体以包囊形式存活下来，推测当温度降到适宜时，包囊能孵化为幼虫，成为再次暴发小瓜虫病的根源。但多子小瓜虫高温应激的分子机制目前尚未见报道。

热激蛋白(Heat-shock proteins，HSPs)是生物适应环境温度变化的重要媒介分子，过高或过低的温度都会诱导细胞或机体产生应激反应，迅速合成HSP，并作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配、运转和降解等过程，以维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激源的耐受性，增强抗氧化作用，使细胞维持正常的生理功能［16-17］。HSP70 为HSPs 中最保守、最重要的一簇，其在大多数生物中含量较多，在应激反应中最敏感［18］，在调节细胞凋亡［19-20］、细胞衰老［21-22］和生育［23］过程中均起着重要的作用。研究表明，环境温度升高时，可以增强HSP70 基因的表达，进而促进细胞的存活，抑制细胞凋亡［24］。当温度升高时，嗜热四膜虫Tetrahymena thermophila在生长、饥饿和接合生殖等生理或发育状态下，HSP70 基因的表达水平随温度的升高而增加［17］。同样，可用HSP70 检测不同地域生物的耐热能力［16］。选用保守的HSP70 作为分子标记来研究同种生物在不同温度诱导下的表达变化规律，可以更好地认识物种耐热的机制。本研究中，克隆了寄生于草鱼的多子小瓜虫HSP70 基因(Im HSP70)的开放阅读框(ORF)，并研究了在3种不同温度下多子小瓜虫HSP70 基因在幼虫、滋养体和包囊3 个不同发育阶段的表达情况，旨在为从分子水平探讨多子小瓜虫的温度适应机理提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 多子小瓜虫来源 寄生有多子小瓜虫的草鱼Ctenopharynodon idellus 取自广东省清远市某草鱼苗种场，苗种场养殖水温为(29 ±3)℃，草鱼体长为(8.5 ±0.53)cm，体质量为(13.35 ±2.51)g。运回实验室后暂养于用活性碳除氯后的自来水中，水温为(25 ±1)℃。

1.1.2 试验鱼 RR -B 系剑尾鱼Xiphophorus hellerii 体长为(5.64 ±0.41)cm，体质量为(6.05±2.12)g，取自珠江水产研究所水生实验动物研究中心。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 将108 尾试验鱼平均分为9 组，暂养于9 个0.1 m3的小池中，暂养用水为除氯后的自来水，适应5 d 后，再与寄生有多子小瓜虫的草鱼，在不同温度(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃的水中混养，每个温度设3 个重复，每个重复中将12 尾剑尾鱼和2 尾携带多子小瓜虫的草鱼混养在一起。

1.2.2 不同温度下多子小瓜虫成虫、包囊和幼虫的获得 取被多子小瓜虫严重感染的剑尾鱼(体表有很多的白点)，轻轻刮鱼体表面，将一定量的水连同多子小瓜虫滋养体倒入培养皿中，轻轻转动培养皿，用吸管将集聚在中央的滋养体吸到另一个培养皿中，用蒸馏水反复清洗3次，直至除去大部分黏液。将滋养体移入装有灭菌蒸馏水的离心管中，参照张其中等［5］的方法，将收集的滋养体分别在(20 ±1)、(25 ±1)、(30 ±1)℃恒温中培育，形成包囊和孵化出幼虫。

1.2.3 总RNA 的提取及cDNA 的合成 分别将不同温度下得到的多子小瓜虫滋养体、幼虫和包囊富集于离心管底部，每个样品加入1 mL 的TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，于-70 ℃下保存。参照TRIzol Reagent 说明书对保存的样品进行总RNA的提取，用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的完整性，用分光光度计检测其浓度和纯度，将高质量的总RNA 于-70 ℃下保存备用。取1 μg 总RNA，通过Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(Roche，Germany)合成cDNA 第一链。分别将GenBank 中已报道的纤毛类嗜热四膜虫T.thermophila(GenBank:JQ697041)、螅状独缩虫 Carchesium polypinum(GenBank:AY561304)HSP70 的mRNA 序列在多子小瓜虫基因组数据库ImDB(www.ich.ciliate.org/blast/)中进行Blast 比对，找到同源序列，再把获得的序列通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)进行再次比对确认，得到多子小瓜虫HSP70 的预测基因序列。用Primer Premier 5.0 软件设计引物F1、R1(表1)，用PCR 扩增HSP70 基因的ORF，扩增产物通过E.Z.N.A.TM Gel Extraction kit 试剂盒(Omega 公司)纯化回收，连接到pGM -T18 载体(TaKaRa公司)中，转化至Escherichia coli DH5α 感受态细胞中，挑取3 个阳性克隆，送上海生物工程有限公司测序。

1.2.4 序列分析用Blast程 序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对测序结果进行同源性检索。使用在线软件SMART(http://smart.embl- heidelberg.de/)对氨基酸序列进行结构和功能域分析。经Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)在线预测蛋白质的二级结构，利用Swiss - model(http://swissmodel.expasy.org/)服务器预测3 -D 结构。使用Clustal W软件将克隆的多子小瓜虫及其他物种HSP70 基因的氨基酸序列进行多重比对，用Mega 4.1 软件构建NJ 系统发育树。

1.2.5 荧光定量RT -PCR 利用Beacon Designer 8.0 软件设计HSP70 特异引物F、R(表1)，进行实时荧光定量PCR 扩增，以18S RNA 作为内参基因，设计引物为IMR - F1、IMR - R1［4］(表1)，用实时定量PCR 检测各基因在各样品中的表达量。反应体系(20 μL):10 μL SYBRⓇPremix Ex TapTM(TaKaRa 公司)，0.4 μL ROX Reference Dye(TaKaRa 公司)，引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反应程序:95 ℃下预变性10 min;95 ℃下变性15 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共进行40 个循环;最后在95 ℃下反应15 s，60 ℃下反应30 s，95 ℃下反应15 s。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequences of primers used in this experiment

1.3 数据处理

以各温度下幼虫、滋养体和包囊的cDNA 为样品，每个样品设置3 个重复样，用实时荧光定量PCR 扩增仪7300 测定目的基因的丰度，应用2-△△CT分析方法，通过ABI7300 系统初步统计，用SPSS 17.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 多子小瓜虫HSP70 基因ORF 序列分析

以多子小瓜虫滋养体cDNA 为模板，采用引物F1和R1，PCR 扩增得到一条1995 bp 的条带，符合预期大小。经Blast 比对及ORF 分析后，确认该序列为多子小瓜虫HSP70 其因的ORF(GenBank登录号:KF626379);将其与多子小瓜虫基因组序列比对发现，Im HSP70 无内含子，ORF 全长为1995 bp，预测编码为664 个氨基酸，理论相对分子质量为72 510，等电点为5.42。正电荷残基(Arg+Lys)85 个，负电荷残基(Asp+Glu)112个，整个蛋白质带-27 价电荷，为膜外蛋白。

经Predictprotein 分析，Im HSP70 的二级结构以α- 螺旋和无规卷曲为主(图1);经Swiss -model 及SMART 分析，Im HSP70 蛋白的空间结构在N 端含有一个高度保守的ATP 酶功能域，在C 端含有一个高度保守的多肽结合功能域(图2、图3)。

图1 Im HSP70 蛋白分子二级结构预测图Fig.1 The deduced secondary structure of the HSP70 from Ichthyophthirius multifiliis

图2 Im HSP70 蛋白分子功能域预测图Fig.2 The deduced domains of the HSP70 from I.multifiliis

图3 Im HSP70 蛋白分子三级结构预测图Fig.3 Tertiary structure of the deduced HSP70 from I.multifiliis

2.2 同源性及系统进化分析

将得到的氨基酸序列与GenBank 中其他寄生虫比较，并通过软件Clustal W 计算同源性。结果显示，Im HSP70 与其他物种的相似性为54.94% ～78.08%(表2)，其中与螅状独缩虫相似性最高(78.08%)。将上述比对结果采用NJ 法重复1000次构建bootstrap 验证的系统发育树(图4)。结果显示:哺乳类、两栖类、爬行类、鸟类聚为一个分支;无脊椎动物果蝇(NP_ 731651)、旋毛形线虫(AAO63753)等聚为另外一个分支;纤毛类的螅状独缩虫(AAS68531)、多子小瓜虫(Im HSP70)、嗜热四膜虫(AAK29100)、变藓棘毛虫(AED86994)聚为一个分支。

表2 Im HSP70 氨基酸序列与其他物种的相似性Tab.2 Identity of HSP70 amino acid in Ichthyophthirius multifiliis with other species

2.3 不同温度下Im HSP70 mRNA在不同发育阶段相对表达水平的比较

采用实时荧光定量PCR 法，分析温度为20、25、30 ℃时多子小瓜虫HSP70 基因在3 个不同发育阶段(幼虫、滋养体和包囊)的相对表达量。结果显示:20 ℃和25 ℃时，Im HSP70 基因在滋养体中的表达量最高，且显著高于其他两个阶段(P＜0.05)，包囊中表达量次之，幼虫中表达量最低;30 ℃时，Im HSP70 基因在包囊中的表达量最高，且显著高于其他两个阶段(P＜0.05)，滋养体中次之，幼虫中最低(图5)。3 个发育阶段中，表达量最大的是25 ℃时滋养体，分别是25 ℃时幼虫、包囊中表达量的179 倍和54 倍。

分别对多子小瓜虫幼虫、滋养体和包囊在20、25和30 ℃时的表达情况进行分析。结果表明:幼虫中HSP70 基因在30 ℃时表达略有增强(P ＞0.05)，分别是25 ℃和20 ℃时的1.75 倍和1.28倍;滋养体中HSP70 的表达量在25 ℃时显著增强(P＜0.05)，在30 ℃时又显著降低(P＜0.05)，呈先升后降的变化趋势;包囊中HSP70 的表达量呈先降后升的变化趋势，在25 ℃时表达量显著降低(P＜0.05)，30 ℃时表达量又显著升高(P＜0.05)。

图4 Im HSP70 与其他物种HSP70 基因氨基酸序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of HSP70 from I.multifiliis and other species

图5 小瓜虫不同发育阶段HSP70 mRNA在不同温度下的相对表达量Fig.5 Relative expression levels of Im HSP70 mRNA in different stages of I.multifiliis at different temperature

3 讨论

3.1 多子小瓜虫HSP70 基因序列与结构特征

有研究表明，HSP70可能是寄生虫-宿主相互作用的一个重要的分子［25］。HSP70 的存在，可以促进感染的宿主细胞成为自然杀伤细胞(NK -cell)介导毒性的靶细胞［26］。HSP70 家族中，共有21种蛋白质，主要包括诱导型HSP70、热激同源蛋白70(heat shock cognate 70，HSC70)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、葡萄糖调节蛋白75等［27］，其中诱导型HSP70 基因的一个显著特征是不含内含子［28］。用本研究中克隆得到的多子小瓜虫HSP70 基因的ORF 与多子小瓜虫基因组序列比对发现，多子小瓜虫HSP70 基因不含内含子，克隆出来的可能属于诱导型HSP70 基因。冯立芳等［17］克隆出嗜热四膜虫的HSP70 基因，明建华等［29］克隆出团头鲂的HSP70 基因，均验证了这个特征。Im HSP70 蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β -折叠为主，这与脊椎动物的HSP70 相似［30］。同源性分析表明，多子小瓜虫HSP70 与其他原生动物HSP70 的氨基酸序列相似性高，与同为纤毛门的螅状独缩虫、嗜热四膜虫、变藓棘毛虫聚在一个分支上，而与哺乳类、鸟类等相距甚远，说明根据HSP70 序列分析的结果与传统的分类结果是一致的。而冯立芳等［17］克隆出嗜热四膜虫的5 个HSP70，编码序列各不相同。Raphaela等［31］分析发现，HSP70 家族中有着不同的基因型成员，说明HSP70 具有多态性，而且在功能上也是有差异的。多子小瓜虫HSP70是否存在其他的类型，还有待进一步研究。

3.2 多子小瓜虫HSP70 基因表达与发育、温度的相关性

多数寄生虫生活史复杂，具有不同的发育阶段。HSP70 基因在不同发育阶段的表达量是否有差异，也是揭示寄生虫抵抗不同环境条件而生存的关键。前人的研究表明，在寄生虫的不同发育阶段，HSP70 的表达存在差异。del Cacho等［32］对柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella 的研究发现，在球虫的发育、成熟和入侵过程中，孢子生殖阶段的HSP70表达量呈递增水平，利用HSP70 的特异性单克隆抗体通过免疫组化等技术分析显示，HSP70表达于孢子形成阶段;HSP70 出现在早期感染阶段可能与虫体在宿主体内受到的应激有关，也可能与子孢子的形成有关。Neumann等［33］对曼氏血吸虫Schistosoma mansoni在不同发育阶段的HSP70 研究发现，HSP70 只表达于胞蚴、童虫和成虫，在尾蚴中不表达，在胞蚴和尾蚴的转型期HSP70 转录终止;但尾蚴转化为童虫和成虫受42 ℃热应激处理后，HSP70表达升高，6 h 达到最高水平。冯立芳等［17］的研究也发现，嗜热四膜虫在生长、饥饿和接合生殖等生理或发育状态下，HSP70 的表达量也是不同的。与其结果相似的是，本研究中通过对3种不同温度下，HSP70 mRNA在多子小瓜虫3 个发育阶段的表达量的研究发现，在幼虫、包囊和成虫3 个发育阶段，HSP70表达量有显著的差异，而且在幼虫阶段表达量最低。Abernathy等［34］利用多子小瓜虫表达序列标签信息比较发现，多子小瓜虫在幼虫、滋养体、包囊的转录因子包括抑动抗原和表质蛋白均表达不同。Yi等［35］发现，木兰科植物厚朴Magnolia officinalis和槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides 的甲醇提取物对小瓜虫幼虫有着很强的杀灭活性，且提取物对幼虫阶段的毒力要显著强于包囊阶段;Ling等［36］也得出同样的结论。本研究结果表明，多子小瓜虫HSP70在幼虫阶段的表达量最低，可能与不同生活史阶段有关。

多子小瓜虫对温度的耐受性存在着明显的差异，分为温带型和热带型［7］，温带型的适宜水温为16 ℃，热带型的适宜水温在16 ～24 ℃。冯立芳等［16］在研究螅状独缩虫的耐热能力时发现，不同纬度地域的螅状独缩虫，其HSP70 高表达的阀值也是不同的。本研究中，多子小瓜虫取自水温为29 ℃下的感染草鱼，这表明多子小瓜虫在29 ℃时仍对草鱼具有致病性，故推测该多子小瓜虫为热带型。del Cacho等［37］对柔嫩艾美耳球虫Eimeria tenella 野生株和2种早熟株的子孢子阶段的HSP70表达研究发现，随着虫株毒力的减弱其子孢子的HSP70表达水平呈递减趋势，表明HSP70在柔嫩艾美耳球虫子孢子中的表达与其致病性相关。HSP70在不同的生物中作为一种抗应激相关因子，当受到外界刺激时，以合成表达HSP70 来提高自身的抵抗力。本研究中，剑尾鱼在30 ℃水温中仍能感染多子小瓜虫病，可能与多子小瓜虫高表达的HSP70 有一定的关系。随着孵育温度的升高，在滋养体中的表达量先上升后降低，在包囊中的表达量先降低后上升。多子小瓜虫受到热刺激时，HSP70 mRNA 转录水平随之出现明显的增加。而当热刺激超过HSP70 蛋白的耐受能力范围时，高HSP70 的表达量可能反馈调节抑制HSP70 基因的表达［38］。多子小瓜虫的幼虫和包囊阶段是生活在水体中，包囊的形成是多子小瓜虫对不良环境的一种很好的适应性，而幼虫却没有这种保护机制，这也可能是包囊与幼虫HSP70表达量不同的原因之一。水温30℃时，滋养体中HSP70 也有一定的表达量，说明在30 ℃时多子小瓜虫滋养体仍具有生物活性。而在包囊中HSP70表达量显著高于滋养体和幼虫，说明包囊的形成有利于抵抗高温的环境。HSP70在包囊中的大量表达也许是多子小瓜虫病在大约30℃的高温时仍能暴发的重要分子机制。因此，有必要对不同温度型的多子小瓜虫在不同温度下以及不同型HSP70在耐热机制中的功能作进一步探讨。

［1］Wei J Z，Li H，Yu H.Ichthyophthiriasis:emphasis on the epizootiology［J］.Applied Microbiology，2013，57(2):91 -101.

［2］黄琪琰.水产动物疾病学［M］.上海:上海科学技术出版社，1993:180 -193.

［3］Dickerson H，Clark T.Ichthyophthirius multifiliis:a model of cutaneous infection and immunity in fishes［J］.Immunol Reviews:Immune Systems of Ectothermic Vertebrates，1998，166(1):377 -384.

［4］Olivier J，Carlo P，Domenica D B，et al.Non - invasive detection and quantification of the parasitic ciliate Ichthyophthirius multifiliis by real time PCR［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2005，65(3):251 -255.

［5］张其中，张占会，陈达丽，等.水温对多子小瓜虫的影响［J］.生态科学，2010，29(2):116 -120.

［6］Mojtaba A，Kurt B.Temperature - dependent protection against Ichthyophthirius multifiliis following immunization of rainbow trout using live theronts［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2006，72(3):269 -273.

［7］Price D J，Clayton M G.Genotype-environment interactions in the susceptibility of the common carp，Cyprinus carpio，to Ichthyophthirius multifiliis infections［J］.Aquaculture，1999，173(1/4):149 -160.

［8］战文斌.水产动物病害学［M］.北京:中国农业出版社，2004:223 -233.

［9］Xu D H，Klesius P H，Shoemaker C A，et al.The early development of Ichthyophthirius multifiliis in channel catfish in vitro［J］.Journal of Aquatic Animal Health，2000，12:290 -296.

［10］Xu D H，Klesius P H.Two year study on the infectivity of Ichthyophthirius multifiliis in channel catfish Ictalurus punctatus［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2004，59:131 -134.

［11］Noe J G，Dickerson H W.Sustained growth of Ichthyophthirius multifiliis at low temperature in the laboratory［J］.Internation Journal for Parasitology，1995，81(6):1022 -1024.

［12］钱龙，艾涛，谢恒修.温室培育乌鳢鱼苗对小瓜虫病的防治［J］.中国水产，1999(10):33.

［13］邓永强，汪开毓，黄小丽.鱼类小瓜虫病的研究进展［J］.大连水产学院学报，2005，20(2):149 -153.

［14］陈爱平，江育林，钱冬，等.小瓜虫病［J］.中国水产，2011(8):37 -38.

［15］梁长辉.盛夏小瓜虫病的防治探讨［J］.渔业致富指南，2011(10):11.

［16］冯立芳，缪伟.不同纬度螅状独缩虫耐热能力及Hsp70 mRNA表达水平的比较［J］.动物学报，2008，54(3):525 -530.

［17］冯立芳，畅悦，袁冬霞，等.嗜热四膜虫五个Hsp70 基因的表达分析［J］.动物学研究，2011，32(3):267 -276.

［18］黄芬，何彰华，李存，等.热激蛋白70 的研究进展［J］.生物技术通讯，2011，22(6):883 -886.

［19］Beere H M，Wolf B B，Cain K，et al.Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome［J］.Nature Cell Biology，2000，2(8):469-475.

［20］Ravagnan L，Gurbuxani S，Susin S A，et al.Heat -shock protein 70 antagonizes apoptosis-inducing factor［J］.Nature Cell Biology，2001，3(9):839 -843.

［21］Kumar Y，Tatu U.Stress protein flux during recovery from simulated ischemia:induced heat shock protein 70 confers cytoprotection by suppressing JNK activation and inhibiting apoptotic cell death［J］.Proteomics，2003，3(4):513 -526.

［22］Zhao Z G，Shen W L.Heat shock protein 70 antisense oligonucleotide inhibits cell growth and induces apoptosis in human gastric cancer cell line SGC-7901［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11(1):73 -78.

［23］Aruda A M，Baumgartner M F，Reitzel A M，et al.Heat shock protein expression during stress and diapause in the marine copepod Calanus finmarchicus［J］.Journal of Insect Physiology，2011，57(5):665 -675.

［24］韩燕，王淑红，孟照俊，等.热处理对HeLa 细胞增殖、凋亡及HSP70表达的影响［J］.陕西医学杂志，2011，40(4):394 -396.

［25］Yang J，Yang L L，Lv Z Y，et al.Molecular cloning and characterization of a HSP70 gene from Schistosoma japonicum［J］.Parasitology Research，2012，110(5):1785 -1793.

［26］Bottger E，Multhoff G，Kun J F，et al.Plasmodium falciparum -infected erythrocytes induce granzyme B by NK cells through expression of Host-Hsp70［J］.PLoS One，2012，7(2):1 -11.

［27］杨秉芬，孙启鸿，曹诚.热激蛋白70 研究进展［J］.生物技术通讯，2009，20(5):716 -719.

［28］Franzellitti S，Fabbri E.Differential HSP70 gene expression in the Mediterranean mussel exposed to various stressors［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2005，336(4):1157 -1163.

［29］明建华，谢骏，刘波，等.团头鲂HSP70 cDNA 的克隆、序列分析以及热应激对其mRNA表达的影响［J］.中国水产科学，2009，16(5):635 -648.

［30］田照辉，徐绍刚，王巍，等.西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70 cDNA 的克隆、序列分析和组织分布［J］.大连海洋大学学报，2012，27(2):150 -157.

［31］Raphaela de C G，Suely L G.Comparative expression analysis of members of the Hsp70 family in the chytridiomycete Blastocladiella emersonii［J］.Gene，2007，386(1):24 -34.

［32］del Cacho E，Gallego M，Pereboom D，et al.Eimeria tenella:hsp70 expression during sporogony［J］.J Parasitol，2001，87(5):946 -950.

［33］Neumann S，Ziv E，Lantner F，et al.Regulation of Hsp70 gene expression during the life cycle of the parasitic helminth Schistosoma mansoni［J］.European Journal of Biochemistry，1993，212(2):589 -596.

［34］Abernathy J，Xu D H，Peatman E，et al.Gene expression profiling of a fish parasite Ichthyophthirius multifiliis:insights into development and senescence-associated avirulence［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，Part D，2011，6(4):382 -392.

［35］Yi Y L，Lu C，Hu X G，et al.Antiprotozoal activity of medicinal plants against Ichthyophthirius multifiliis in goldfish(Carassius auratus)［J］.Parasitol Research，2012，111:1771 -1778.

［36］Ling F，Wang J G，Lu C，et al.Effects of aqueous extract of Capsicum frutescens(Solanaceae)against the fish ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis［J］.Parasitol Research，2012，111:841 -848.

［37］del Cacho E，Gallego M，López - Bernad F，et al.Differences in Hsp70 expression in the sporozoites of the original strain and precocious lines of Eimeria tenella［J］.Parasitology，2005，91(5):1127 -1131.

［38］Kiang J G，Tsokos G C.Heat shock protein 70 kDa:molecular biology，biochemistry，and physiology［J］.Pharmacology ＆ Therapeutics，1998，80(2):183 -201.