甲基泼尼松龙对急性期脊髓损伤 bcl-2 等凋亡基因的影响

郑力恒 林宏生 张国威 李锦聪 谢林 张大卫

甲基泼尼松龙对急性期脊髓损伤 bcl-2 等凋亡基因的影响

郑力恒 林宏生 张国威 李锦聪 谢林 张大卫

目的 观察甲基泼尼松龙 ( methylprednisolone，MP ) 干预对急性期脊髓损伤凋亡相关基因bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 相对表达量的影响，并探讨该药物促进脊髓功能修复的机制。方法 实验动物随机分为假手术组 ( S 组 )、单纯损伤组 ( C 组 ) 与 MP 治疗组 ( T 组 ) 各 36 只，采用改良 Allen’s 法制作急性脊髓损伤模型，在损伤后 8 h、24 h、3 天、7 天、14 天和 28 天随机取各组 6 只动物处死，实时荧光定量 PCR 测量标本的 ΔCt 值并进行分析。结果 T 组 bcl-2 基因 ΔCt 值均小于 C 组，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )；bax 基因在 T 组术后 3 天、14 天和 28 天 ΔCt 值大于 C 组，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )，T 组 8 h、24 h 和 7 天三个时间点 ΔCt 值与 C 组，差异无统计学意义 ( P＞0.05 )；T 组 cytc 基因 ΔCt 值大于 C 组，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )；T 组 caspass-9 基因 ΔCt 值大于 C 组，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )。结论 甲强龙可以通过 bcl-2、cytc 及 caspass-9 的表达起到保护受伤节段脊髓的作用。

脊髓损伤；凋亡调节蛋白质类；功能恢复；甲基泼尼松龙

细胞凋亡是脊髓继发性损伤的重要原因之一，bcl-2 及其基因家族是公认的与细胞凋亡有关的基因。甲基泼尼松龙 ( methyprednisolone，MP ) 是目前临床上使用的唯一经过美国 FDA 认证及推荐的用于治疗急性脊髓损伤的药物，研究[1]证实 MP 具有保护神经功能可能是由于抑制了神经细胞凋亡，从而保护了相应的神经功能，但其具体机制尚不清楚。本实验观察甲基泼尼松龙干预对急性期脊髓损伤后凋亡相关基因 bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 相对表达量的影响，进一步探讨该药物促进脊髓功能修复的机制，总结报告如下。

材料与方法

一、材料

1. 实验动物：成年新西兰大白兔 108 只，体重为 1.8～2.5 kg。

2. 试剂：液氮、氯仿、异丙醇、乙醇 ( DEPC水新鲜配制 )、DEPC 水、Trizol 试剂，由广东赛哲生物科技有限公司提供；BiooPure，由美国 Bioo Scientific 公司提供；Fermentas EN0521、Fermentas K1622、Fermentas K0223，由 FERMENTAS 公司提供；微量 RNA 共沉淀剂，由上海泛柯生物技术有限公司提供；即用型荧光定量 PCR 试剂盒，由北京天恩泽基因科技有限公司提供。引物合成：由上海英骏生物技术有限公司合成：Beta-actin 引物序列：上游：5’-GGCATCCTGACGCTCAAGTA-3’，下游序列：5’-TGGGTCTAGTACAAGCTCTGC-3’，扩增片段长度为 192bP；bcl-2 引物序列：上游序列：5’-CTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，下游序列：5’-CGTACAGTTCCACGAAGGCATC-3’，扩增片段长度为 161bP；bax 引物序列：上游序列：5’-GCTTCAGGGTTTCATCCAGG-3’，下游序列：5’-GTCCAGTTCGTCGCCAATG-3’，扩增片段长度为 136bP；cytc 引物序列：上游序列：5’-GCCGCCCTATCGTGTTGTGTCA-3’，下游序列：5’-GCAGTTTAGCAGAGGGTGGGGT-3’，扩增片段长度为 77bp；caspass-9 引物序列：上游序列：5’-TGAAGCCTGACCTGACCGCCAA-3’，下游序列：5’-TGACAACCACGCAGCAGTCCAG-3’，扩增片段长度为 93bp。

二、方法

1. 分组、模型建立：将实验动物随机分为3 组：假手术组 ( S 组 ) 36 只，仅手术打开 T8～10段椎管，不损伤脊髓组织；单纯损伤组 ( C 组 ) 36 只，手术打开 T8～10段椎管，改良 Allen’s 法对脊髓组织造成损伤后不予药物治疗；MP 治疗组 ( T 组 ) 36 只，手术打开椎管，改良 Allen’s 法对脊髓组织造成损伤，立即按 30 mg / kg 静脉注射 MP 治疗，伤后 1 h 即开始按 5.4 mg / kg 的总量分 4 次静脉注射[2]。术后实验动物分笼喂养，定期按摩膀胱，所有实验动物肌肉注射青霉素 80 万单位预防感染，连续 3 天。实验中若出现死亡及淘汰的动物及时补充。

2. 脊髓 RNA 标本提取：各组动物分别于术后8 h、24 h、3 天、7 天、14 天和 28 天处死，取脊髓，置于用液氮预冷的研钵中迅速研磨成粉末，每50～100 mg 组织加入 0.5 ml BiooPure。加入 100 μl体积的氯仿 ( 为 BiooPure 总体积的 1 / 5 )，室温下静置 5 min，12 000 rpm 4 ℃ 离心 15 min，吸取上清加1 μl RNA 共沉淀剂，再加入等量的异丙醇 250 μl 室温静置 10 min，12 000 rpm 4 ℃ 离心 10 min，弃上清。加 1 ml 70% 乙醇，7500 rpm 4 ℃ 离心 5 min。待 RNA 略干后，加 10 μl DEPC 水溶解。分光光度计检测 RNA 浓度。

3. RNA 纯化：取 0.2 ml PCR 管，并依次加入1 μg RNA、1 μl 氯化镁反应缓冲液、1 μl DNA 酶I 依次按量加入，最后添加经 DPEC 处理过的蒸馏水使总体积至 10 μl，然后放置在 37 ℃ 温箱内孵育30 min，后加入 1 μl 50 mmol / L EDTA ，在 65 ℃ 温箱内孵育 10 min。

4. 反转录：取 0.2 ml PCR 管，依次加入上述去除 DNA 的 1 μg 总 RNA，并加入 1 μl 六聚体引物后加入蒸馏水至 12 μl 放入 65 ℃ 温箱内恒温处理5 min，以用来打开 RNA 的 G-C 富集区。将样品于冰上冷却后加入 4 μl 反应缓冲液、1 μl RNA 酶抑制剂 ( 由 RiboLock 公司生产 )、1 μl 逆转录酶 ( 由RevertAid 公司生产 ) 和 2 μl 10 mmol / L dNTP 混合液放置于 25 ℃ 温箱内抚育 5 min，然后于 42 ℃ 温箱内中孵育 60 min，最后将上述样品置于 70 ℃ 温箱内处理 5 min 灭活逆转录酶，进行 RT-PCR 反应。

5. 荧光定量 PCR 反应：采用荧光定量 PCR 试剂盒，加入 1 μl Beta-actin 引物、1 μl bcl-2 / bax / cytc / caspass-9 引物、1 μl cDNA，最后加入蒸馏水 9.5 μl，从而保证总体积为 25 μl，然后进行 PCR 反应。其中，起始温度为 95 ℃，持续 10 min，循环 1 次；变性温度 95 ℃，持续 15 s，退火温度因各种引物的不同有所差异，bcl-2、bax 为 61 ℃，cytc、caspass-9退火温度为 62 ℃，持续 1 min，循环 40 次；然后进行解离程序，分别在 95 ℃ 持续 15 s，60 ℃ 持续1 min，95 ℃ 持续 15 s，循环 1 次。

三、统计学处理

采用 SPSS 13.0 统计学软件进行统计数据处理，对实验中所得到的 Ct 值，采用 beta-actin 校订后，得到 ΔCt 值进行析因设计方差分析和 SNK 法进行多个样本均数间的多重比较。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、各时间点 bcl-2 表达量差异

对照组各个时间点的 ΔCt 值平均值 ( 8.43 ) 大于空白组各个时间点 ΔCt 值的平均值 ( 8.33 ) 并大于实验组各个时间点 ΔCt 值平均值 ( 7.58 )，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )，从图1C 可以看出：在对照组，尤其在 8 h、7 天、14 天和 28 天，ΔCt 值低；在 24 h和 3 天组，ΔCt 值高；实验组在各个时间段 ΔCt 值均低于对照组；而实验组在 24 h、7 天和 28 天三个时间点 ΔCt 值较同组其他时间点低。由上述结果可以得出结论：( 1 ) 对于未经 MP 治疗的急性脊髓损伤动物，在伤后 24 h 和 3 天时间点，bcl-2 表达量下降，而在 8 h、7 天、14 天和 28 天时间点 bcl-2 表达量增高；( 2 ) 采用 MP 治疗组相比对照组 bcl-2 表达量增高，而且在 24 h 和 7 天两个时间点与对照组差距较大。

图1 A：bcl-2 扩增曲线；B：bcl-2 标准曲线，曲线的方程为 Y = ( -3.575 ) X + 28.661，扩增效率为 90.41%；C：为空白组、对照组和实验组在不用的时间点 bcl-2 基因表达 ΔCt 值均值，结果显示实验组 ΔCt 值均小于对照组 ( P＜0.05 )Fig.1 A: The amplification curve of the gene bcl-2; B: The standard curve of the bcl-2, and the equation is Y=( -3.278 )X+28.714. The amplification effency is 101.85%; C: The curve of the means of ΔCt of gene bcl-2. Gene bcl-2 in group C is more higher than group T ( P＜0.05 )

二、各时间点 bax 表达量差异

空白组各个时间点 ΔCt 值的平均值 ( 7.46 ) 大于实验组各个时间点 ΔCt 值平均值 ( 6.84 ) 并大于对照组各个时间点的 ΔCt 值平均值 ( 6.38 )，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )。从图2C 中可以看出虽然实验组各个时间点 ΔCt 值均大于同时间点对照组 ΔCt值，但从整体上看，两条曲线相差不大，尤其是在24 h、3 天和 7 天三个时间点。因此考虑极有可能MP 治疗急性脊髓损伤主要使 bcl-2 表达提高，从而间接提高 bcl-2 / bax 形成异源二聚体的比例来起到抗细胞凋亡的作用。

三、各时间点 cytc 表达量差异

空白组各个时间点 ΔCt 值的平均值 ( 8.32 ) 大于实验组各个时间点 ΔCt 值平均值 ( 6.13 ) 并大于对照组各个时间点的 ΔCt 值平均值 ( 3.11 )，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )。从图3C 中可以看出实验组各个时间点 cytc ΔCt 值均大于同时间点对照组 cytc ΔCt 值且差距较大，且在 24 h、3 天、7 天实验组与对照组差距较大，在 3 天时间点实验组 cytc ΔCt 值达到最大。表明 MP 可以使得脊髓损伤动物受伤脊髓节段cytc 表达减低。

四、各时间点 caspass-9 表达量差异

空白组各个时间点 ΔCt 值的平均值 ( 9.57 ) 大于实验组各个时间点 ΔCt 值平均值 ( 8.05 ) 并大于对照组各个时间点的 ΔCt 值平均值 ( 5.51 )，差异有统计学意义 ( P＜0.05 )。从图4C 中可以看出各个时间点 caspass-9 ΔCt 值均大于同时间点对照组 caspass-9 ΔCt 值，且差距较大，而在 7 天时间点实验组与对照组差距最大，由上图可以看出，MP 可以使得脊髓损伤动物受伤脊髓节段 caspass-9 表达减低。

图4 A：caspass-9 的扩增曲线；B：caspass-9 标准曲线，曲线的方程为 Y = ( -2.989 ) X + 34.189，扩增效率为 105.04%；C：为空白组、对照组和实验组在不用的时间点 caspass-9 基因表达 ΔCt 值均值，实验组 ΔCt 值均小于对照组 ( P＜0.05 )Fig.4 A: The amplification curve of the caspass-9; B: The standard curve of caspass-9, and the equation is Y = ( -3.545 ) X + 29.345. The amplification effency is 91.46%; C: curve of the means of ΔCt of caspass-9. There are more caspass-9 in group C than that in group T ( P＜0.05 )

讨 论

MP 是目前临床上使用的唯一经过美国 FDA 认证及推荐的用于急性脊髓损伤的药物。大量研究认为 MP 的神经保护作用包括[3-4]：改善受伤局部微循环；抑制脂质过氧化；减少细胞钙内流；维持神经元兴奋性等。随着近年来对 MP 治疗急性脊髓损伤的研究不断加深，认为 MP 具有保护神经功能可能是由于抑制了神经细胞凋亡[5]，从而保护了相应的神经功能。

细胞凋亡是一个涉及凋亡基因表达及相关蛋白质合成的过程。在目前研究与凋亡有关的基因中，bcl-2 及其基因家族是被公认的与细胞凋亡有关的基因的一种，而在 bcl-2 基因家族中，bcl-2 和 bax是目前被研究最多的两个基因，二者分别为抑制凋亡基因和促进凋亡基因。Kotipatruni[6]在实验中发现在大鼠中重度脊髓损伤的相应脊髓节段 bcl-2 免疫呈阳性反应；Vaquero[7]通过 bcl-2 基因转导入腺病毒并注射至实验大鼠相应受伤脊髓节段内，发现bcl-2 具有保护脊髓的作用。Men 等[8]通过实验证明bcl-2 起到抗细胞凋亡的作用往往要以形成异源二聚体的形式。Tsujimoto[9]认为当 bcl-2 / bax 形成的异源二聚体的表达比例高于同源二聚体时，即高于bax / bax 及 bcl-2 / bcl-2 时起到抗细胞凋亡作用。因此，异源二聚体的形成比例是决定细胞是否抑制凋亡的关键因素。本实验中设计的 bax 引物制作其扩增曲线，并未见形成双峰现象，表明引物并未形成二聚体，MP 治疗急性脊髓损伤主要使 bcl-2 表达提高，从而间接提高 bcl-2 / bax 形成异源二聚体的比例来起到抗细胞凋亡的作用。

bcl-2 特定的 BH3 域蛋白与促凋亡蛋白结合，通过直接与 bax 和 bak 结合触发凋亡；抗凋亡的bcl-2 家族成员隔离了 BH3 域蛋白，阻断了 bax 和bak 促凋亡；促凋亡成员 bax 和 bak 通过与一种或两种抗凋亡 bcl-2 蛋白结合而处于一种无效的构象状态。Shimizu[10]认为线粒体中的 bcl-2 可以通过与bax 结合形成二聚体导致 bax 功能失活，从而抵消bax 的所有功能。本实验对 bax 的检测显示，急性脊髓损伤后实验动物的 bax 基因表达量升高，MP 的冲击治疗可以使 bax 表达量下降；而作为促凋亡因子bax 的降低，能明显提高 bcl-2 / bax 的比值。这一现象说明，MP 冲击疗法可以有效的提高脊髓局部节段bcl-2 表达量、降低 bax 表达量，抑制细胞凋亡。

越来越多的研究表明，细胞色素 C 在细胞凋亡中起到重要作用，细胞色素 C 的释放与重新定位，其本身可以激活 Apas-1 和 caspase-9 的前体[10]，从而激活 caspase 途径引起细胞凋亡，当出现大量抑制性物质时，特别是内源性抑制物如 bcl-2 等，由于其在呼吸链中作用重要，通过细胞色素 C 这一路径引起的凋亡便会终止，因此，线粒体中细胞色素 C 的缺失导致呼吸链受抑制，进而引起细胞坏死。bcl-2 可抑制线粒体释放细胞色素 C，从而抑制caspase 途径激活的细胞凋亡的发生。

本实验采用荧光定量 PCR 的方法，对 bcl-2、bax、cytc 和 caspass-9 进行检测，发现采用 MP 治疗组相比对照组 bcl-2 表达量增高，bax 表达量降低，cytc 及 caspass-9 表达量降低，且 cytc 及 caspass-9两者有呈正相关性。线粒体途径是通过 bcl-2 家族中促凋亡基因激活 cytc 进而激活 caspass-9 从而完成细胞凋亡的途径，猜测 MP 通过提高 bcl-2 表达，降低 cytc 的表达，从而抑制 caspass-9 的表达，这一路径受到阻滞，从而起到抗细胞凋亡的作用。因PCR 技术本身的限制，并不能对其转录翻译的产物进行分析，因此还需要下一步通过蛋白印记等技术对其转录翻译的产物进一步研究，对此机制进一步证实。

[1] 郑力恒, 林宏生, 李锦聪, 等. 脊髓损伤后急性期甲基泼尼松龙干预对脊髓神经细胞凋亡的影响. 中国脊柱脊髓杂志, 2012, 22(5):452-458.

[2] Sayer FT, Kronvall E, Nilsson OG. Methylprednisolone treatment in acute spinal cord injury: the myth challenged through a structured analysis of published literature. Spine, 2006, 6(3):335-343.

[3] Madsen JR, MacDonald P, Irwin N, et al. Tacrolimus (FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats. Exp Neurol, 1998, 154:673-683.

[4] Gerndt SJ, Rodriguez JL, Pawli JW, et al. Consequences of high-dose steroid therapy for acute spinal cord injury. Trauma, 1997, 42:2279-2284.

[5] Wen Ru Yu, Tianyi Liu, Tara K, et al. Involvement of mitochondrial signaling pathways in the mechanism of Fasmediated apoptosis after spinal cord injury. Eur J Neurosci, 2009, 29(1):114-131.

[6] Kotipatruni RR, Dasari VR, Veeravalli KK, et al. P53- and baxmediated apoptosis in injured rat spinal cord. Neurochem Res, 2011, 36(11):2063-2074.

[7] Vaquero J, Zurita M, Oya S, et al. Early administration of methylprednisolone decreases apoptotic cell death after spinal cord injury. Histol Histopathol, 2006, 21(10):1091-1102.

[8] Men BZ, Zhou DB, Zhang XM, et al. Bcl-2/Bax gene expression in different types of carotid plaque. Zhong Guo Yi Xue Ke Xue Yuan Bao, 2005, 27(2):241-244.

[9] Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family proteins in apoptosis: apoptosomes or mito chondria. Genes Cells, 1998, 3(11):697-707.

[10] Shimizu S, Konishi A, Kodama T, et al. BH4 domain of antiapoptotic Bcl-2 family members closes voltage-dependent anion channel and inhibits apoptotic mitochondrial changes and cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(7):3100-3105.

( 本文编辑：马超 )

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Effects of methylprednisolone on the neurocyte apoptotic genes such as bcl-2 following acute spinal cord injury

ZHENG Li-heng, LIN Hong-sheng, ZHANG Guo-wei, LI Jing-cong, XIE Lin, ZHANG Da-wei. Centro Hospitalar Conde de Sào Januário, Macau, 999078, PRC

ObjectivesTo observe the effects of methylprednisolone ( MP ) on the neurocyte apoptotic genes such as bcl-2, bax, cytc caspass-9 following acute spinal cord injury ( SCI ) and investigate the mechanisms of spinal cord recovery.MethodsAll experimental rabbits were divided randomly into 3 groups: sham group ( group S, 36 rabbits ), control group ( group C, 36 rabbits ) and MP treatment group ( group T, 36 rabbits ). The spinal cord injury models were made according to Allen’s weight-drop method. 6 rabbits were selected randomly and sacrifced at 8 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d after the injury. The RTFQ- PCR test were taken according to their injured spinal sections, and the results of ΔCt were compared and analyzed.ResultsThe results of ΔCt of gene bcl-2 in group T was lower than in group C, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ). At 3 d, 14 d and 28 d after the injury, the results of ΔCt of gene bax was higher in group C than in group T, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ). No signifcant differences were found between group C and T at 8 h, 24 h and 28 d ( P＞0.05 ). Group T had better expressions in the ΔCt of gene cytc and caspass-9 than group C at all time points, which is statistically signifcant ( P＜0.05 ).ConclusionsMP plays a protective role in treating the acute spinal cord injury by affecting the expressions of the bcl-2, cytc and caspass-9 gene.

Spinal cord injuries; Apoptosis regulatory proteins; Recovery of function; Methyprednisolone

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.01.012

R683.2

澳门科学技术发展基金 ( 026/2010/A )；广东省科技计划项目 ( 2010-170-1 )

999078 澳门，澳门仁伯爵综合医院 ( 郑力恒，谢林 )；澳门医学科技研究协会 ( 郑力恒，李锦聪，谢林 )；510632 广州，暨南大学骨科疾病研究所 ( 郑力恒，林宏生，张国威，张大卫 )；暨南大学附属第一医院骨一区 ( 林宏生，张国威，张大卫 )

林宏生，Email: tlinhs@jnu.edu.cn

2013-05-09 )