miR-122靶向调控心肌样细胞诱导分化过程中GATA4基因的表达

郭励京 张 志 刘紫东 付 伟 季 州

miR-122靶向调控心肌样细胞诱导分化过程中GATA4基因的表达

郭励京 张 志△刘紫东 付 伟 季 州

目的 实现大鼠骨髓间充质干细胞（bMSCs）向心肌样细胞的诱导分化，并验证分化过程中miR-122靶向调控GATA4基因的表达。方法首先，分离培养bMSCs，应用5-氮杂胞苷（5-azacytidine）将其诱导分化为心肌样细胞。然后，采用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-122和GATA4基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。qRT-PCR检测诱导分化过程中miR-122和GATA4的表达。结果诱导分化后的细胞平行排列，紧密相连，形态规则均一，免疫荧光化学显示有心肌肌钙蛋白I（cTnI）表达。生物信息学方法预测发现miR-122和GATA4基因两者匹配良好，通过双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-122能结合到GATA4 mRNA的3′UTR并有效抑制其表达。qRT-PCR检测结果表明，miR-122的表达水平与GATA4表达呈负相关。结论miR-122能调控心肌样细胞诱导分化过程中GATA4的表达。

间质干细胞；微RNAs；GATA4转录因子；3′非翻译区；计算生物学；大鼠,Sprague-Dawley；miR-122；心肌样细胞

MicroRNA（miRNA）是一类内源性的小的非编码RNA（small noncoding RNA），长度约为21～25 nt，可通过与靶基因mRNA的3′非翻译区（3′UTR）完全或部分互补，进而降解该目的mRNA或阻止其翻译成相关蛋白，下调靶基因表达[1]，以此参与个体发育、细胞分化、细胞增殖以及疾病发生过程中的基因表达调控。GATA4是心肌细胞发育过程中最早表达的转录因子之一，在胚胎心脏发育的整个过程中均表达，对心肌细胞的分化起重要作用，是调控心脏发育以及心肌细胞增殖、分化和调亡的重要转录因子[2-4]。本研究应用5-氮杂胞苷（5-azacytidine）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（bMSCs）分化为心肌样细胞，利用生物信息学对miR-122和GATA4基因的靶向匹配关系进行预测，并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定，实时定量PCR（qRT-PCR）检测诱导分化过程中miR-122和GATA4的表达，以阐明miR-122对GATA4基因表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠，普通级，3～6周龄，体质量80～120 g，购于中国医科大学实验动物部，生产许可证SCXK(辽) 2008-0005。

1.1.2 菌株、质粒和细胞系 E.coli DH5α感受态细胞和pMD 18-T载体购自TaKaRa公司，pmirGLO载体购自Promega公司，NIH3T3细胞系为辽宁医学院附属三院心内科保存。

1.1.3 主要试剂与仪器 LG-DMEM培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶购于Hyclone公司，CD34、CD44、CD29和CD166荧光标记抗体购于Biolengent公司，5-azacytidine购自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆心肌肌钙蛋白I（cTnI）抗体购自Santa Cruz公司，RNAiso Plus、RNAiso for small RNA、Prime-Script™Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq™Ⅱ、限制性内切酶、DNA Ligation Kit Ver.2.0购于TaKaRa公司，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒和AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购自Axygen公司，Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，miRNA模拟物由GenePharma公司合成，Dual-Luciferase®报告基因检测系统和发光检测仪购自Promega公司，实时定量PCR仪购于Bio-Rad公司。

1.2 bMSCs的分离与培养 取4～6周SD大鼠，脱颈处死，70%乙醇浸泡5 min，取其股骨和胫骨，PBS洗净，去掉干骺端，用1 mL无菌注射器，吸取1 mL含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 g/L链霉素的DMEM，反复冲出骨髓，吹打均匀后，接种到25 cm2培养瓶内，于37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d后，换液弃去未贴壁细胞。每3～4 d换一次液，待细胞达到80%融合后传代，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化3 min，用含血清的培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，收集细胞1∶2传代，记作P1。

1.3 流式细胞仪鉴定bMSCs 收集P3代细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，分装于6只1.5 mL离心管内，每管1 mL，分别与FITC和PE荧光素标记的CD29、CD34、CD44、CD166抗体孵育1 h后，上流式细胞仪检测。

1.4 心肌样细胞的诱导分化及鉴定 （1）诱导分化。取P3细胞接种于培养瓶和铺有血盖片的6孔板内做诱导分化，培养基中加入10 μmol/L 5-azacytidine培养24 h后，PBS冲洗2次，更换完全培养基培养3周，倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态。（2）免疫荧光检测cTnI的表达。取细胞爬片PBS冲洗后，在冷空气中迅速干燥，用4%甲醛固定20 min，PBS冲洗3次，每次5 min，0.1%BSA封闭1 h，加兔抗大鼠多克隆cTnI抗体，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，抗体浓度（1∶200），Hochest 33258复染细胞核。

1.5 生物信息学预测 采用靶基因预测软件miRanda(http:// www.microrna.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)对 miR-122和GATA4基因的靶向匹配关系进行预测。

1.6 miR-122靶基因GATA4的鉴定

1.6.1 GATA4 3′UTR的克隆 取诱导培养20 d的心肌样细胞，加入RNAiso Plus提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计检测总RNA纯度和浓度，用RNasefree水稀释为1 g/L，按PrimeScript™Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书，反转录为cDNA，利用正向引物5′-CCGAGCTCCCTGCCCTTGTCCAACACTC-3′和反向引物5′-GCTCTAGACCTTCTCCTCACCTAAACCC-3′扩 增 GATA4 mRNA的3′UTR片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并按AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明回收目的片段，克隆到pMD 18-T载体上，测序。

1.6.2 GATA4 3′UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体的构建 分别用SacⅠ和XbaⅠ双酶切pmirGLO质粒载体以及回收得到的GATA4 3′UTR，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物及胶回收，按DNA Ligation Kit Ver 2.0说明，将回收的GATA4 3′UTR酶切片段与pmirGLO载体酶切片段相连，构建GATA4 3′UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体，转化入DH5α感受态细胞中克隆扩增，按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明从菌液中提取重组质粒，用SacⅠ和XbaⅠ酶切质粒鉴定。

1.6.3 NIH3T3细胞转染与荧光素酶检测 NIH3T3细胞培养在含10%FBS的DMEM培养基中，转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%～95%。对于每孔细胞，利用Lipofectamine 2000转染GATA4 3′UTR-pmir-GLO 200 ng以及miR-122模拟物或对照miRNA 30 nmol/L，转染24 h后，按照Dual-Luciferase®报告基因检测系统说明检测不同处理组的荧光强度。每个处理设置3个重复，每个转染实验重复3次。

1.7 qRT-PCR检测miR-122及GATA4的表达 取诱导5、9、13、17和21 d的细胞，分别加入RNAiso for small RNA或RNAiso Plus提取总miRNA或总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测质量，紫外分光光度计检测纯度和浓度，用RNase-free水稀释为1 g/L，按照One Step PrimeScript®miRNA cDNA Synthesis Kit说明书反转录，得到的cDNA样品稀释4倍，加入SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ和miR-122检测引物（通用检测引物试剂盒自带）或GATA4检测引物，见表1，以U6或GAPDH为内参基因，在Chromo4TM多色实时定量PCR仪(Biorad)上进行40个循环的qPCR反应，应用Opticon-3软件定量分析反应结果，miR-122和GATA4 mRNA的表达量分别用U6和GAPDH标准化。每次定量分析检测样品设置3个重复，以3批样品进行独立表达分析。

1.8 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，两变量关联性应用Pearson相关进行分析，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 bMSCs流式细胞仪鉴定结果 大鼠bMSCs高表达间充质干细胞相关标志物CD29（90.12%）、CD44（94.62%）、CD166（63.27%），而造血干细胞标志物CD34（1.23%）表达阴性，见图1。

2.2 诱导后细胞形态学观察 bMSCs传至3～4代，分布均匀，呈梭形，折光性强，见图2A。诱导3周后细胞变细长，平行排列，紧密相连，形态规则均一，见图2B；细胞免疫荧光显示分化2周后细胞内有cTnI表达，显示绿色荧光，见图2C～E。

2.3 miR-122和GATA4靶向匹配关系预测结果 TargetScan结果表明miR-122在GATA4 mRNA的3′UTR上有1个哺乳动物间保守的靶位点，靶位点类型为7mer-m8，“context+score”百分数为56，其与靶位点互补情况良好。miRanda显示miR-122与靶位点匹配的mirSVR得分为-0.143 7，miRNA与3′UTR结合情况良好，见表2。

2.4 miR-122可直接调控GATA4的表达 荧光强度分析结果显示，将对照组miRNA（在小鼠细胞系中无任何靶基因）的荧光素酶活性设定为1时，miR-122组的荧光素酶活性为（53.74±6.38）%，差异有统计学意义（t=3.648，P=0.007）。

2.5 心肌样细胞诱导分化的过程中miR-122和GATA4的表达关系 qRT-PCR结果显示，将诱导5 d细胞mRNA的表达量值设为1时，诱导9 d GATA4 mRNA的表达量为4.54±1.82，诱导21 d时升至11.71±6.84，而miR-122的表达量诱导9 d下降为（57.76±7.57）%，诱导21 d下降至（23.86±5.64）%，见图3。随着诱导时间的延长，miR-122与GATA4表达水平呈负相关（n=8，r=-0.863，P=0.006）。

3 讨论

GATA家族是具有锌指结构的转录因子，目前已知有6个成员，因其识别序列(A/T)GATA(A/G)而得名，根据组织分布以及氨基酸序列同源程度分为2个亚家族：GATA1～3主要在造血系统中表达，而GATA4～6主要在内胚层和中胚层来源的组织中表达，如心脏、肝脏、消化系统和生殖腺等[5]。GATA4是近年来心血管领域的研究热点，GATA4基因敲除小鼠由于心脏发育缺陷致胚胎期死亡[5]；过表达的GATA4可促进P19细胞向心肌细胞分化[6]。Ieda等[7]研究发现GATA4、Tbx5与MEF2c转录因子联合作用可将心脏成纤维细胞及皮肤成纤维细胞诱导成为心肌样细胞，而且，GATA4还能调控心脏成纤维细胞的增殖[8]。GATA4能调控Bcl基因发挥抗凋亡作用[9]。这些研究均证明GATA4是调控心脏发育以及心肌细胞增殖、分化和凋亡的重要转录因子。GATA4还是许多信号通路中MAPK激酶ERK和p38的下游靶标[10]。因此，GATA4是多种信号通路的整合者及下游效应分子，在心脏发育中发挥着重要的作用。

miRNA作为一类小的内源性非编码RNA已被证实广泛参与生命活动过程中的基因表达调控，但对于miRNA参与心肌样细胞诱导分化方面却知之甚少，为此，本研究运用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-122和GATA4基因的靶向匹配关系进行预测，发现两者匹配关系良好。miRanda是第一个靶基因预测软件，其适用范围宽广，不受物种限制，除了传统的miRNA与靶基因碱基互补方面的要求外，Betel等[11]更新了算法mirSVR，作为一种新的机器学习方法，mirSVR将预测的靶位点的序列和结构特征（contextual features）整合并建立回归模型，不需要定义种子区亚类（seed subclasses）。然而，TargetScan是用于预测哺乳动物miRNA靶基因的软件，其以靶基因跨物种保守和miRNA-靶基因二聚体热力学特征为基础，并首次引入假阳性率来评价靶基因预测结果。后来，Lewis等[12]将TargetScan优化为TargetScanS,把miRNA种子区修订为5＇端第2到7位碱基，并根据靶位点与miRNA的互补情况，将靶位点分为3种类型：与miRNA种子区精确匹配且与miRNA第1位核苷酸对应处为A(7mer-1A sites)，与miRNA第2到8位精确匹配（7mer-m8 sites），与miRNA第2到8位精确匹配且与miRNA第1位核苷酸对应处为A（8mer sites）。

笔者进一步通过双荧光素酶报告系统研究发现，miR-122能够靶向作用于GATA4 3＇UTR抑制GATA4的表达。qRT-PCR结果表明，随着诱导时间的延长，miR-122的表达量逐渐降低，而GATA4的表达量逐渐升高，两者呈负相关，与荧光素酶报告系统检测结果相符，提示miR-122参与了心肌样细胞的诱导分化过程，其具体的调节机制及与其他几种重要转录因子的关系还需进一步的研究。

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（2013-10-10收稿 2013-12-02修回）

（本文编辑 李国琪）

GATA4 Expression During Induction of the Cardiomyocyte-Like Cells Differentiation Regulated by miR-122

GUO Lijing,ZHANG Zhi,LIU Zidong,FU Wei,JI Zhou
Department of Cardiology,The Third Affiliated Hospital,Liaoning Medical University,Jinzhou 121001,China

ObjectiveTo identify the miR-122 which regulateing GATA4 expression during the induction of rat bone marrow mesenchymal stem cells(bMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.MethodsBMSCs were isolated from bone marrow and induced to differentiate into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The miR-122 which may regulate expression of GATA4 were predicted using miRanda and TargetScan softwares and identified by dual luciferase report system.The expressions of miR-122 and GATA4 were determined using q-PCR during the differentiation of bMSCs into cardiomyocyte-like cells.ResultsThe induced cells were completely in contacted with adjoining cells and uniform in shape and aligned parallelly.Cardiac troponin I(cTnI)expression was detected by immunofluorescence cytochemistry.Using dual luciferase reporter system in vitro,miR-122 were proved to be able to effectively inhibit GATA4 expression by binding the 3′UTR of GATA4 mRNA.q-PCR results showed that the expression of miR-122 is negatively correlated with that of GATA4 mRNA transcription.ConclusionThese results indicated that miR-122 regulate the expression of GATA4 during the induction of cardiomyocyte-like cells.

mesenchymal stem cells;MicroRNAs;GATA4 transcription factor;3′untranslated regions;computational biology;rats,Sprague-Dawley;miR-122;cardiomyocyte-like cells

Q522,R318.04

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.013

辽宁医学院附属第三医院心内科（邮编121001）

△通讯作者 E-mail:ningcheng631@163.com