鞘氨醇激酶1和核因子-κB p65在非小细胞肺癌组织中的表达及与预后的关系

畅 昶 徐美林 王 菁

鞘氨醇激酶1和核因子-κB p65在非小细胞肺癌组织中的表达及与预后的关系

畅 昶1徐美林2Δ王 菁2

目的 探讨鞘氨醇激酶1（SPHK1）和核因子（NF）-κB在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与NSCLC浸润、转移和预后的关系。方法选取93例外科手术切除并经常规组织学检查确诊为NSCLC的标本和癌旁正常的余肺组织，应用免疫组化SP法，一抗分别为兔抗人SPHK1，NF-κB p65抗体，二抗为快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，检测石蜡切片的NSCLC组织SPHK1和NF-κB的表达情况。结果SPHK1和NF-κB在NSCLC组织中的阳性率分别为96.8%（90/93）和89.2%(83/93)，均高于其在正常肺组织中的阳性率18.3%（17/93），12.9%(12/93)。SPHK1和NF-κB在NSCLC组织中的表达呈正相关（r＝0.464，P＜0.01）。TNM分期越高，SPHK1和NF-κB p65高表达比例就越高；有淋巴结转移者的SPHK1和NF-κB p65高表达率高于无淋巴结转移组；死亡者的SPHK1和NF-κB p65高表达率高于存活者，生存分析显示SPHK1高表达组患者的生存时间短于SPHK1低表达组的生存时间（χ2=14.025，P＜0.01）。结论SPHK1可能通过NF-κB在NSCLC侵袭、转移的过程中发挥重要作用，并可能成为提示NSCLC患者预后并进行靶向治疗的指标。

癌，非小细胞肺；NF-κB；免疫组织化学；预后；鞘氨醇激酶1；非小细胞肺癌

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发生率和病死率均呈上升趋势。目前尽管应用了各种先进的诊断、治疗措施，但肺癌的疗效数十年来无明显提高，五年生存率仅有10%～15%，肿瘤细胞的转移是影响肺癌预后的主要因素。鞘氨醇激酶1（SPHK1）是一种鞘氨醇的代谢酶，在肿瘤的形成和转移方面发挥重要的作用。核因子（NF）-κB是细胞内的核转录因子，其在肿瘤细胞外基质的降解、细胞的黏附和移动及其移动后肿瘤细胞局部的血管形成等诸多环节均起重要作用。有研究证实SPHK1、NF-κB在多种恶性肿瘤中高表达，并且影响患者的预后[1-2]。然而在非小细胞肺癌（NSCLC）中，SPHK1和NF-κB的表达与转移、预后之间的关系并不明确。本研究通过检测SPHK1和NF-κB在NSCLC组织及正常肺组织中的表达，观察其与NSCLC临床病理之间的关系，进一步验证SPHK1和NF-κB对NSCLC的生物学行为的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集天津市胸科医院2009年1月—12月NSCLC手术切除标本93例，所有病例均经过病理证实，术前均未经过放疗、化疗等相关治疗。其中男60例，女33例。年龄43～82岁，中位年龄62岁。随访日期2009年1月，截止日期2012年8月，生存期从手术日期截止到随访日期，或截止到由于复发转移而死亡的日期。鳞癌45例，腺癌36例，腺鳞癌12例。低分化52例，中分化32例，高分化9例。TNM分期，Ⅰ期58例，Ⅱ期16例，Ⅲ期19例。

1.2 方法 选取外科手术切除并经常规组织学检查确诊为NSCLC的标本和癌旁正常的余肺组织，经10%中性福尔马林液固定，常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，连续切片5～6张，每张厚度5 μm，免疫组化采用SP两步法，一抗兔抗人SPHK1抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，稀释为1∶200，一抗NF-κB p65抗体购于北京中杉金桥生物技术公司，稀释为1∶100，二抗为快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物和二氨基联苯胺（DAB）均购于福建迈新生物技术有限公司，二甲苯脱蜡，乙醇脱苯，3%的H2O2去除内源性过氧化物酶，使用柠檬酸高压修复法修复，一抗水浴1 h，二抗水浴20 min DAB染色，苏木素复染，封片。

1.3 判定标准 免疫组织化学染色方法和结果判定参考文献[3]，SPHK1和NF-κB均以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色程度和染色细胞百分比进行评定和分析：基本不着色者为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；着色细胞占计数细胞的百分比率小于5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分；大于51%为3分。将每张切片的染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为中等阳性（++），大于6分为强阳性（+++）。表达-或+为低表达组，++～+++为高表达组。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行处理，计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验，对生存数据采用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异性，采用COX风险模型进行独立预后因素分析，应用Pearson积矩相关系数进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPHK1和NF-κB p65的表达 NSCLC组织中SPHK1、NF-κB p65均在细胞质中表达，细胞质呈现棕黄色或者棕褐色，其阳性率分别是96.8%（90/93）和89.2%(83/93)。在癌旁正常余肺组织中，SPHK1、NF-κB均在细胞质中表达，呈现黄色，其阳性率分别为18.3%（17/93）和12.9%(12/93)。SPHK1、NF-κB在NSCLC组织中的阳性率均高于其在正常肺组织中的阳性率（χ2分别为117.259和108.459，均P＜0.01）。根据评分标准，SPHK1和NF-κB在癌旁正常余肺组织中均为低表达，而在NSCLC组织中部分阳性病例可归为高表达，其中高表达率分别为50.3%（47/93）和47.3%(44/93)，SPHK1和NF-κB的阳性表达情况在NSCLC组织中呈正相关，见图1～3，表1。

2.2 SPHK1和NF-κB p65表达与患者临床病理特征的关系 TNM分期越高，SPHK1和NF-κB p65高表达比例就越高；有淋巴结转移者的SPHK1和NF-κB p65高表达率高于无淋巴结转移组；死亡者的SPHK1和NF-κB p65高表达率高于存活者，见表2。

2.3 SPHK1与预后之间的关系 高表达组生存时间低于低表达组（χ2=14.025，P＜0.01），见图4。

3 讨论

SPHK1是调节细胞内鞘脂代谢的关键酶，其可通过催化神经酰胺或鞘氨醇磷酸化产生一磷酸鞘氨醇(S1P)，神经酰胺和鞘氨醇可以诱导细胞凋亡，然而S1P却起到相反的作用，通过多种方式来起到抵抗细胞凋亡促进细胞增殖的作用。细胞内神经酰胺与S1P含量的多少决定了细胞是凋亡还是增殖[4]，而两者之间的含量多少则由SPHK1的含量和活性决定。体内许多生长因子通过酪氨酸激酶受体（RTKs）激活SPHK1，使其通过磷酸化鞘氨醇而产生更多的S1P，从而促进细胞的存活和增殖，细胞内增多的S1P可以进一步通过RTKs激活更多的SPHK1，形成一个正反馈的环路，SPHK1在此环路中起着重要的作用[5]。S1P可以被转运体转运至细胞外，以一种自分泌或者旁分泌的方式来刺激它的特异性受体，这个过程被称为“由内而外的信号转导”[6]，S1P有5个特异性的G蛋白偶联受体（GPCR），即：S1P1～5[7]。有研究表明，信号转导子与转录活化子3蛋白（STAT3）可以诱导S1P1的表达，S1P又可以通过S1P1受体激活STAT3，在肿瘤微环境的形成过程中以及肿瘤恶性化的过程中，STAT3的稳定表达是必要的[8]。S1P还可以上调Mcl-1，使多发性骨髓瘤细胞减少凋亡[9]。在许多恶性肿瘤中都证实了SPHK1的高表达，例如，有研究证实在结肠癌组织中SPHK1表达阳性，正常的黏膜组织为阴性或弱阳性，高表达的SPHK1的病例更易转移[10]；食管癌组织中SPHK1高表达，高表达组的患者生存时间低于低表达组[11]；高表达的SPHK1可以促进乳腺癌细胞生长，侵袭，转移，同时增加了乳腺癌细胞对化疗药物的抵抗。在对乳腺癌的研究中发现，正常乳腺组织中不表达，非典型增生的组织中呈现低表达，乳腺癌组织中呈现高表达[12]。

NF-κB是一种可诱导的二聚体核转录因子，而p50/p65异源二聚体为NF-κB家族的主要形式[13]。NF-κB参与众多的病理生理学过程，在许多炎细胞因子和激素的刺激下，向细胞核内聚集，调控细胞因子，趋化因子等基因的表达，进而影响机体细胞凋亡，肿瘤生长的生物学功能[14-16]。

有研究表明，在NSCLC组织中，SPHK1是过表达的，通过PCR可以检测到NSCLC肿瘤细胞中SPHK1 mRNA上调，同样也可以检测到上调的NF-κB，除了NF-κB含量增加外，过表达的SPHK1还可以增强NF-κB的活性，使用特异性SPHK1的抑制剂SK1-I或者使用特异性的siRNA靶向沉默SPHK1的表达均可减少细胞内SPHK1和NF-κB的表达。过表达SPHK1的细胞可以抵抗凋亡，在使用阿霉素或多烯紫杉醇诱导过表达SPHK1的细胞进行凋亡的过程中，如果同时使用NF-κB的抑制剂，过表达SPHK1的细胞就会大量凋亡[17]。这就表明SPHK1需要依赖于NF-κB来发挥促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡的作用，在NSCLC中NF-κB通路对于SPHK1的抗凋亡作用是必需的。NSCLC的进展与SPHK1的高表达有关，SPHK1的高表达有助于维持NSCLC细胞的生存，降低其对凋亡诱导剂的敏感性。本研究结果也显示，SPHK1与NF-κB在NSCLC中的表达呈现正相关，两项指标在NSCLC组织中阳性表达，同时NSCLC的分化程度越低，侵袭和远处转移，TNM分期越高，预后越差，其阳性程度越高。存活患者和死亡患者肿瘤组织中SPHK1表达的差异性，也进一步证实了SPHK1在NSCLC转移和侵袭过程中发挥的重要作用。

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（2013-08-07收稿 2014-01-02修回）

（本文编辑 魏杰）

Expression Level of Sphingosine Kinase 1 and Nuclear Factor-κB p65 in Non-Small Cell Lung Cancer and Their Relationship with Tumor Prognosis

CHANG Chang1,XU Meilin2，WANG Jing2
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Pathology,Tianjin Chest Hospital

ObjectiveTo investigate expression level of sphingosine kinase 1(SPHK1)and nuclear factor-κB(NF-κB)in non-small cell lung cancer(NSCLC)and their relationships with invasion,metastasis and prognosis of NSCLC.MethodsNinety-three NSCLC specimens and paraneoplastic normal lung tissue from conventional surgery were confirmed by histology.Expression of SPHK1 and NF-κB were detected by Immunohistochemistry on paraffin sections.Primary antibody were Rabbit Anti-Human SPHK1 and Rabbit Anti-Human NF-κB p65,which were incubated 1 hour in water bath.The secondary antibody was HRP-Polymer anti Mouse IgG,which was incubated 20 minutes in water bath.ResultsSPHK1 expression was positive in 96.8%(90/93)of NSCLC specimen which is higher than in paraneoplastic normal lung tissue in which the positive rate is 18.3%(17/93);NF-κB expression was positive in 89.2%(83/93)NSCLC which is higher than the in paraneoplastic normal lung tissue in which the positive rate is 12.9%(12/93).The expression of SPHK1 and NF-κB in NSCLC was positively correlated(r=0.464,P＜0.01).TThe expression levels of SPHK1 and NF-κB p65 in NSCLC patients with were positively related to TNM staging and lymph node metastasis.SPHK1 expression and NF-κB p65 expression level were higher in the deads than in survivals.There was no statistical significance in different expression intensity of SPHK1 and NF-κB p65 in patients with NSCLC who had differences in gender,age,tumor size,tumor location,histological type. Survival analysis showed that survival time of patients of NSCLC with high expression of SPHK1 was shorter than those in the group with low SPHK1 expression,and the difference was statistically significant(χ2=14.025,P＜0.01).ConclusionIn the process of NSCLC invasion and metastasis，SPHK1 may play an important role through NF-κB,and it can predict prognosis of NSCLC patient.Moreover,it will become a potential target for NSCLC target.

carcinoma,non-small-cell lung;NF-kappa B;immunohistochemistry;prognosis;sphingosine kinase 1; NSCLS

R734.2，R365

B

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.005

1天津医科大学（邮编300070）；2天津市胸科医院病理科

△通讯作者 E-mail:meilinxugh@sina.com