MTA1沉默抑制鼻咽癌转移能力的体外研究

涂英华 练祖平 谢有科

MTA1沉默抑制鼻咽癌转移能力的体外研究

涂英华 练祖平 谢有科△

目的 探究MTA1基因敲除后对鼻咽癌细胞株5-8F细胞转移能力的影响。方法设计并构建针对MTA1基因的RNAi片段，脂质体（LipofectamineTM2000）介导Si-MTA1-01（Si-MTA1-01组）和Si-MTA1-02（Si-MTA1-02组）感染5-8F细胞，同时设无义序列转染组（Si-ctr组）为对照。应用荧光定量PCR和蛋白印迹法检测转染后各组细胞的MTAl mRNA和蛋白表达；细胞划痕实验、基底膜侵袭实验和细胞黏附实验检测转染后5-8F细胞迁移和侵袭能力的变化，并进行比较分析。结果与Si-ctr组相比，Si-MTA1-01和Si-MTA1-02组MTA1 mRNA及蛋白表达水平下降，穿膜细胞数减少，细胞黏附率增加（均P＜0.05），划痕实验显示细胞阻滞效果明显。结论沉默MTA1能明显减弱鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力，MTA1有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

鼻咽肿瘤；RNA干扰；细胞迁移分析；细胞黏附；细胞系,肿瘤；印迹法,蛋白质；逆转录聚合酶链反应；MTA1；鼻咽癌；5-8F细胞

鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，放疗是最主要的治疗方法。即使经过正规和系统治疗,大多数患者还是死于局部进展和（或）远处转移[1]。MTA1是与许多肿瘤发生及转移有关的一个重要基因，有研究显示鼻咽癌中MTA1基因过表达，并且与肿瘤转移、复发和患者生存期关系密切[2-3]。本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术抑制鼻咽癌细胞株MTA1表达，观察其对鼻咽癌细胞体外转移能力的影响，探讨MTA1成为鼻咽癌治疗的新的分子靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌细胞株5-8F由南方医科大学肿瘤研究所惠赠。RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清为Hyclone原装进口，SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（TaKaRa），Transwell小室（孔径8 μm）购自Coming公司，纤维连接蛋白（FN）为Sigma公司产品，MTA1多克隆抗体为Epitomics公司产品，增强型化学发光检测试剂盒（ECL）、β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗、抗兔二抗均为康为世纪公司产品；RIPA及PMSF蛋白裂解液为碧云天公司产品。Mx3005PTM Real Time PCR仪为Stratagene公司产品；倒置相差显微镜为Olympus公司产品；凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 瞬时转染 设计及合成针对MTA1基因的siRNA序列：Si-MTA1-01序列5′-GGAGAGATTCGAGTAGGAAAC-3′，Si-MTA1-02序列5′-GCAGCAGAAACGCTTGAAAGC-3′。转染前1 d，接种5-8F细胞于6孔板中，在细胞密度达到30%～50%汇合度时，将培基换成无血清培基。将稀释好的干扰片段与LipofectamineTM2000脂质体轻柔混匀，室温孵育20 min，形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，在5%CO2、37℃培养箱中培养，6 h后更换完全培养基。48～72 h后检测干扰效率。以Si-ctr（5′-GACGACGATAAGGGATCCTGA-3′，不针对任何已知人mRNA）为对照组。

1.2.2 qRT-PCR检测干扰效率 转染48 h后收集各组细胞，TRIzol法提取RNA，检测RNA浓度和纯度后，按照TaKaRa逆转录试剂盒说明合成cDNA，TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR试剂盒说明进行qRT-PCR，GAPDH为内参。MTA1引物：上游5′-AGCTACGAGCAGCACAACGGGGT-3′，下游5′-CACGCTTGGTTTCCGAGGAT-3′；GADPH上游5′-TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT-3′，下游 5′-TGCTGTAGCCAAATTCG TTG-3′。总反应体系20μL，反应条件：95℃预变性30 s；95℃10 s、57℃10 s，72℃9 s，45个循环；95℃1 min、56℃30 s，95℃30 s，绘制熔解曲线。结果判定采用2－ΔΔCT法：△CT=CT目的基因－CT内参，△△CT=△CT处理组－△CT对照组，处理组的相对表达值=2－△△CT，对照组的相对表达量=1。各组均设复孔3个，实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测干扰效率 转染72 h后收集各组细胞，PBS洗涤3次，加入RIPA裂解液和PMSF，BCA法蛋白定量，配制10%SDS-PAGE分离胶和5%SDS-PAGE浓缩胶，每组取25 μg进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶恒压80 V 30 min，分离胶恒压100 V 90 min。采用湿转法进行转膜，根据蛋白Marker所指示的条带位置，将目的蛋白及内参蛋白β-actin所在范围的膜裁剪下来，放入有封闭液（含5%BSA的TBST）的平皿中浸泡，室温孵育1 h。用封闭液稀释一抗，MTA1兔抗人多克隆抗体(1∶250稀释)和β-actin鼠抗人单克隆抗体（1∶1 000稀释），室温孵育1 h后4℃孵育过夜。次日取出膜，TBST洗膜15 min；分别加入HRP标记的抗兔、抗鼠二抗(1∶1 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜15 min。膜稍滴干后置于暗盒内，加入化学发光试剂孵育，迅速曝光，曝光时间为15 s左右,仪器扫描记录。

1.2.4 细胞划痕实验 取各组细胞，转染后24 h，0.25%胰酶消化，计数板计数，每组细胞密度约为6×106个/mL，接种至24孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞长成单层后弃去培养液，用灭菌枪头在24孔板底部单层细胞的中央划出一划痕，洗去死细胞后，换成减半血清完全培养基继续培养，分别于0 h和48 h在显微镜下拍照。

1.2.5 Matrigel侵袭实验 取各组细胞，转染后24 h，0.25%胰酶消化，无血清培养基洗涤2次后，细胞计数，调整细胞浓度为1×106/mL，加100 μL细胞悬液于铺有Matrigel基质胶的上室，然后加500 μL 10%胎牛血清的完全培养基于下室37℃培养8 h，取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，甲醇固定15 min，Giemsa染液染色5 min，用刀片小心切下聚碳酸酯膜，置于载玻片上，中性树胶封片，镜下随机读取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数，取平均值,每组重复3次。

1.2.6 细胞黏附实验 取各组细胞，转染后24 h，消化细胞，细胞计数，以每组1×104细胞接种于纤维连接蛋白（FN,1 g/L）包被的96孔板中，每组设3复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h，PBS洗涤未黏附的细胞，每孔加入含200 μL RPMI 1640培养液基和5 g/L的MTT 20 μL，37℃继续培养4 h后弃掉孔内培养基，加入DMSO 150 μL，室温孵育10 min，微振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，酶标仪上490 nm测定各孔密度光度（OD）值。黏附率=处理组OD值/对照组OD值×100%。取平均值,每组重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR和Western blot结果 与Si-ctr组相比，Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组中MTA1 mRNA分别下降（87.34±4.87）%和（89.07±5.08）%（均P＜0.05）；Western blot亦显示，Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组MTA1蛋白表达较Si-ctr组明显减少，见图1、2。

2.2 沉默MTA1对5-8F细胞迁移能力的影响 Sictr组两侧细胞愈合较快，边缘不整齐，而Si-MTA1-01和Si-MTA1-02组两侧细胞愈合速度明显减慢，见图3。

2.3 干扰MTA1对5-8F细胞侵袭能力的影响 各组细胞均穿透Matrigel基质胶向下侵袭，Si-ctr组、Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组穿膜细胞数分别为196.6±18.2、68.0±12.3和72.21±14.9，差异有统计学意义（F=68.190，P＜0.01），与Si-ctr组相比，Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组穿过基质胶的细胞数明显减少（均P＜0.05），见图4。

2.4 下调MTA1对5-8F细胞基质黏附能力的影响 Si-ctr组、Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组的黏附率分别为（100.00±3.56）%、（164.22±6.09）%和（179.67±9.32）%，差异有统计学意义（F=117.076，P＜0.01），与Si-ctr组相比，Si-MTA1-01组和Si-MTA1-02组细胞黏附率明显增高（均P＜0.05），见图5。

3 讨论

MTA是一类新发现的与肿瘤进展有关的基因家族，因最初是在鼠转移性乳腺癌中经cDNA库差异筛选技术发现而命名，包括3个在分开的位点编码的不同基因（MTA1在14q32，MTA2在11q12-q13.1，MTA3在2p21）和几个选择性剪接形式（MTA1s，MTA1-ZG29p，MTA3L）[4]。目前的研究热点主要集中在MTA1基因，MTA1 cDNA全长为2 756 bp，包含1个独立阅读开放框，位于人染色体14q32.3,编码含703个氨基酸残基的蛋白质[5]。作为核小体重塑和去乙酰化(NuRD)复合物不可缺的亚基之一,MTA1在肿瘤发生发展中的重要性被广泛认知[6]。人类多种肿瘤中MTA1表达均普遍上调[7],在肿瘤形成及侵袭过程中起着关键作用。MTA1在子宫内膜癌[8]、卵巢癌[9]，前列腺肿瘤[10]、乳腺癌[11]、结肠癌[12]和肺癌[13]等肿瘤中均过度表达，且与肿瘤的发生、侵袭、转移和预后密切相关。Jiang等[14]发现沉默MTA1基因表达后，乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖和侵袭能力明显抑制，表明该基因可能在乳腺癌的生长、转移和侵袭中发挥重要作用。Li等[3]运用免疫组化分析了208例鼻咽癌组织中MTA1基因的表达情况，结果显示48.6%MTA1蛋白过表达，其过表达与淋巴结转移、临床分期、远处转移有关，MTA1蛋白表达程度越高，患者预后越差，提示MTA1有望成为判断鼻咽癌预后的一个新指标。Deng等[2]也得出了类似的结论。但MTA1在鼻咽癌中的作用和机制仍不清楚。本研究运用RNAi沉默5-8F细胞中MTA1基因表达，结果显示,下调MTA1基因的表达后，5-8F细胞的迁移和侵袭能力明显越弱，提示沉默MTA1基因能明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力，进一步证实MTA1与鼻咽癌细胞侵袭和转移相关的可能性。

综上，沉默MTA1基因表达后能抑制鼻咽癌细胞的转移能力，这表明MTA1基因在鼻咽癌转移中起着重要作用。但鼻咽癌的发生机制是一个复杂的过程，涉及多个癌基因和抑癌基因[15]。MTA1基因在鼻咽癌转移中所起的作用必须放在基因调节网络这个大背景中进行研究。因此，有必要进一步对MTA1基因可能相互作用的蛋白分子及可能参与的信号通路进行深入研究。

[1]于湛,李光,丁丝露,等.鼻咽癌放疗预后影响因素的COX分析[J].中国医科大学学报,2011,40(8):755-759.

[2]Deng YF,Zhou DN,Ye CS,et al.Aberrant expression levels of MTA1 and RECK in nasopharyngeal carcinoma:association with metastasis,recurrence,and prognosis[J].Ann Otol Rhinol Laryngol, 2012,121(7):457-465.

[3]Li WF,Liu N,Cui RX,et al.Nuclear overexpression of metastasisassociated protein 1 correlates significantly with poor survival in nasopharyngeal carcinoma[J].J Transl Med,2012,10:78.

[4]Manavathi B,Kumar R.Metastasis tumor antigens,an emerging family of multifaceted master coregulators[J].J Biol Chem,2007,282(3): 1529-1533.

[5]Toh Y,Nicolson GL.The role of the MTA family and their encoded proteins in human cancers:molecular functions and clinical implications[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(3):215-227.

[6]黄春蓓,胡国华.MTA1在肿瘤中的作用机制研究进展[J].局解手术学杂志,2012,21(4):423-424.

[7]Hofer MD,Tapia C,Browne TJ,et al.Comprehensive analysis of the expression of the metastasis-associated gene 1 in human neoplastic tissue[J].Arch Pathol Lab Med,2006,130(7):989-996.

[8]Balasenthil S,Broaddus RR,Kumar R.Expression of metastasis-associated protein 1(MTA1)in benign endometrium and endometrial adenocarcinomas[J].Hum Pathol,2006,37(6):656-661.

[9]Prisco MG,Zannoni GF,De Stefano I,et al.Prognostic role of metastasis tumor antigen 1 in patients with ovarian cancer:a clinical study [J].Hum Pathol,2012,43(2):282-288.

[10]Iguchi H,Imura G,Toh Y,et al.Expression of MTA1,a metastasisassociated gene with histone deacetylase activity in pancreatic cancer[J].Int J Oncol,2000,16(6):1211-1214.

[11]Jang KS,Paik SS,Chung H,et al.MTA1 overexpression correlates significantly with tumor grade and angiogenesis in human breast cancers[J].Cancer Sci,2006,97(5):374-379.

[12]Higashijima J,Kurita N,Miyatani T,et al.Expression of histone deacetylase 1 and metastasis-associated protein 1 as prognostic factors in colon cancer[J].Oncol Rep,2011,26(2):343-348.

[13]Zhu X,Guo Y,Li X,et al.Metastasis-associated protein 1 nuclear expression is associated with tumor progression and clinical outcome in patients with non-small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol,2010,5(8):1159-1166.

[14]Jiang Q,Zhang H,Zhang P.ShRNA-mediated gene silencing of MTA1 influenced on protein expression of ER alpha,MMP-9,CyclinD1 and invasiveness,proliferation in breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7 in vitro[J].J Exp Clin Cancer Res, 2011,30:60.

[15]Loyo M,Brait M,Kim MS,et al.A survey of methylated candidate tumor suppressor genes in nasopharyngeal carcinoma[J].Int J Cancer,2011,128(6):1393-1403.

（2013-10-11收稿 2013-12-19修回）

（本文编辑 李国琪）

Silencing of MTA1 Attenuates Nasopharyngeal Carcinoma Metastasis in vitro

TU Yinghua,LIAN Zuping,XIE Youke
Department of Oncology,Ruikang Hospital,Guangxi University of Chinese Medicine,Guangxi 530011,China

ObjectiveTo investigate the effects of MTA1 knock down on migration and invasion of NPC cell 5-8F in vitro.Methods RNAi(Si-MTA1-01 and Si-MTA1-02)that can transiently silenced MTA1 was designed,synthesized and transfected into 5-8F cells by lipofectamine 2000.Control group(transfection with nonsense sequence)was also established.The efficiency of MTA1 depletion was determined by q-PCR and Western blot.Wound-healing assay,Matrigel invasion assay and thesolid-phase adhesion assay were performed to investigate the effect of MTA1 knockdown on 5-8F cell metastasis.ResultsTransiently knock down of MTA1 decreased MTA1 transcription and expression in 5-8F cells compared to shRNA-con cells,showing by Real-time PCR and western blot.The invasion and migration of the cells transfected with siRNA-MTA1 were much weaker than the control group(P＜0.05).Conclusionsilencing MTA 1 gene can effectively inhibit the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell,and might be a promising target for NPC treatment.

nasopharyngeal neoplasms;RNA interference;cell migration assays;cell adhesion;cell line,tumor;blotting,Western;reverse transcriptase polymerase chain reaction;MTA1；nasopharyngeal cancer;5-8F cell

R739.6

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.006

广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科（邮编530011）

△通讯作者 E-mail:xieyouke_1978@163.com