siRNA抑制Mcl-1基因表达对胃癌细胞MGC-803生物学行为的影响*

刘金禄 王 震 陈俊强 崔希刚 马鹏飞 黎伯培

siRNA抑制Mcl-1基因表达对胃癌细胞MGC-803生物学行为的影响*

刘金禄 王 震 陈俊强△崔希刚 马鹏飞 黎伯培

目的 探讨siRNA抑制Mcl-1基因表达后对胃癌细胞MGC-803生物学行为的影响。方法合成针对Mcl-1的靶向siRNA（Mcl-1 siRNA组），以空白细胞（空白对照组）和分别转染脂质体试剂（脂质体对照组）及阴性对照siRNA（阴性对照组）作为对照组。噻唑蓝（MTT）实验检测Mcl-1 siRNA对MGC-803细胞增殖能力的影响；流式细胞术观察各组细胞凋亡及周期变化情况；转染48 h后应用Transwell小室分析细胞侵袭、迁移能力的变化。结果Mcl-1 siRNA组转染后24 h、48 h、72 h的A值低于3个对照组（P＜0.05），其细胞增殖抑制率分别为8.9%、21.6%和18.8%。转染48 h后，Mcl-1 siRNA组细胞凋亡率高于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组（%：19.61±1.66 vs 3.69±0.37 vs 3.54±0.47 vs 3.68±0.55，F=12.230，P＜0.05）。Mcl-1 siRNA组G0/G1[（41.03±1.86）%]、G2/M期[（1.80±0.46）%]比例均低于3个对照组，S期比例[（57.17±1.72）%]高于3个对照组（均P＜0.05）。Mcl-1 siRNA组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（分别是42.00±4.00、76.33±3.51）均低于空白对照组（分别是79.33±3.51、108.00±3.61）、脂质体对照组（分别是74.67±2.52、110.67±4.04）和阴性对照组（分别是77.33±3.06、109.33±4.51）。以上指标在3个对照组间差异均无统计学意义。结论抑制Mcl-1表达可有效降低胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，并促进肿瘤细胞凋亡。

胃肿瘤；RNA,小分子干扰；细胞增殖；细胞凋亡；细胞侵袭；细胞迁移；siRNA；髓样细胞白血病-1基因

髓样细胞白血病-1(myeoid cell leukemin-1, Mcl-1)基因是Bcl-2基因家族的一员[1]，有研究指出降低Mcl-1的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡并导致其细胞周期阻滞[2-3]。但目前有关抑制Mcl-1基因表达对胃癌细胞周期、侵袭转移能力等方面影响的研究仍较少。本研究前期研究发现，低分化胃癌细胞株MGC-803中存在Mcl-1的高表达。本研究在此基础上探讨Mcl-1对胃癌细胞MGC-803生长、侵袭转移、细胞凋亡及细胞周期的影响，以期进一步明确其与胃癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株MGC-803购自中国科学院上海细胞所；DMEM培养基购自美国Gibco公司；标准胎牛血清购自美国HyClone公司；Lipofectamine 2000脂质体购自美国invitrogen公司；细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒购自南京凯基公司；纤维粘连蛋白（FN）购自美国Solarbio公司；Matrigel胶购自美国BD公司；噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA合成 根据Mcl-1（NM_021960）基因信息利用siRNA Designer System按照siRNA干扰片段的设计原则设计siRNA序列，送上海吉玛公司合成，前期实验筛选出有效片段，正义链5′-GCA GGA UUG UGA CUC UCA UTT-3′，反义链5′-AUG AGA GUC ACA AUC CUG CTT-3′；同时合成FAM标记的阴性对照，正义链5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反义链5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.2.2 实验分组与转染 实验设4组。（1）空白对照组：未进行任何转染的胃癌细胞MGC-803。（2）脂质体对照组：转染脂质体。（3）阴性对照组：转染阴性对照序列。（4）Mcl-1 siRNA组：转染Mcl-1 siRNA干扰序列。分别按脂质体Lipofectamine 2000说明书于96孔板进行瞬时转染，每组设5个复孔。

1.2.3 胃癌细胞增殖能力检测 参照文献[4]进行胃癌细胞增殖能力检测。分别取转染后0 h（转染时间点）、24 h、48 h、72 h的各组胃癌细胞，向每孔加5 g/L MTT溶液20 μL；避光在培养箱内继续培养4 h后终止培养。每孔加DMSO100 μL，避光振荡充分溶解结晶物。用酶标仪测定光吸收（A）值，测定波长为570 nm；绘制生长曲线。细胞增殖抑制率(%)=（A空白对照组-AMcl-1siRNA组）/A空白对照组×100%。

1.2.4 胃癌细胞凋亡检测 收集转染后48 h的细胞，调整细胞个数到（1～5）×105个并制成悬浮细胞，先加入5 μL AnnexinV-FITC混匀，再加入5 μL PI混匀。室温、避光反应5～15 min；在1 h内用激发波长488 nm，发射波长530 nm的流式细胞仪观察和检测。

1.2.5 胃癌细胞周期分布检测 分别取转染后48 h的各组胃癌细胞制成细胞悬液，并调整细胞浓度至1×106/mL。加入400 μL PI染色，流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，用620 nm波长滤器检测红色荧光，收集数据用MultiCycle分析软件进行细胞周期的分析，分别计算G0/G1期、S期和G2/M期细胞的相对比例。

1.2.6 胃癌细胞侵袭及迁移能力检测 按照Transwell及Matrigel说明书操作。侵袭实验于Transwell小室涂抹纤维粘连蛋白和Matrigel胶构建基底膜，迁移实验不构建基底膜。分别取转染后48 h的各组胃癌细胞制成2×105/mL的细胞悬液，取100 μL加入Transwell小室，培养24 h后擦去上室内的细胞，结晶紫染色后正置显微镜观察3～5个视野计数取均值，计算穿膜细胞数。

1.3 统计学方法 数据应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mcl-1 siRNA对胃癌细胞增殖的影响 除转染后0 h各组A值差异无统计学意义外，转染后24 h、48 h、72 h Mcl-1 siRNA组A值均低于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组（均P＜0.05），空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组3组间A值比较差异无统计学意义，见表1。Mcl-1 siRNA组转染后24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率分别为8.9%、21.6%和18.8%。

Table 1 Time effect of siRNA interference on MGC-803 cell growth表1 各组siRNA干扰后不同时点A值比较（n=3±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与Mcl-1 siRNA组比较，P＜0.05；表2、3同

组别空白对照组脂质体对照组阴性对照组Mcl-1 siRNA组F 0 h 0.510±0.010 0.504±0.007 0.515±0.008 0.516±0.008 0.851 24 h 0.952±0.018a0.939±0.026a0.950±0.016a0.867±0.027 19.965＊48 h 1.557±0.022a1.529±0.026a1.545±0.039a1.220±0.051 110.481＊＊72 h 2.153±0.052a2.064±0.059a2.063±0.060a1.748±0.013 168.835＊＊

2.2 Mcl-1 siRNA对胃癌细胞凋亡的影响 Mcl-1 siRNA组细胞凋亡率（19.61±1.66）%明显高于空白对照组（3.69±0.37）%、脂质体对照组（3.54±0.47）%和阴性对照组（3.68±0.55）%，差异有统计学意义（F=12.230，P＜0.05），而空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组间差异无统计学意义，见图1。

2.3 Mcl-1 siRNA对胃癌细胞周期的影响 转染48 h后各组MGC-803细胞中细胞周期的分布情况见图2。Mcl-1 siRNA组G0/G1、G2/M期比例均低于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组，S期比例高于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组（均P＜0.05）。空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组细胞周期分布差异无统计学意义，见表2。

2.4 Mcl-1 siRNA对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响 Mcl-1 siRNA组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数均低于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05），空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组间比较差异均无统计学意义，见表3、图3、4。

Table 2 MGC-803 cell cycle distribution of each group表2 各组MGC-803细胞周期分布比较（n=3，%±s）

组别空白对照组脂质体对照组阴性对照组Mcl-1 siRNA组F G0/G1期64.00±2.29a65.90±2.85a67.30±2.48a41.03±1.86 269.898＊＊S期25.40±0.85a26.03±1.10a24.63±1.01a57.17±1.72 921.818＊＊G2/M期10.60±1.49a8.07±1.76a8.07±1.48a1.80±0.46 11.066＊

Table 3 Comparing cell invasion and migration ability in different groups表3 各组细胞侵袭、迁移能力（穿膜细胞数）比较（n=3，个s）

组别空白对照组脂质体对照组阴性对照组Mcl-1 siRNA组F侵袭能力79.33±3.51a74.67±2.52a77.33±3.06a42.00±4.00 30.941＊＊迁移能力108.00±3.61a110.67±4.04a109.33±4.51a76.33±3.51 17.459＊

3 讨论

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居所有肿瘤的第2位；我国是胃癌高发的国家，其发病率位居各类肿瘤前列[5-6]。有研究发现Mcl-1蛋白在胃癌组织中的表达明显高于非癌胃黏膜组织，并且与肿瘤的T分期、临床分期、肿瘤细胞的转移和血管浸润密切相关[7-9]。在晚期胃癌特别是侵犯浆膜的胃癌中Mcl-l蛋白的表达较高[10]。对胃癌细胞株的研究发现，Mcl-1蛋白在多种胃癌细胞系中高表达，且其表达明显高于正常胃黏膜细胞系[7,11]。由此提示Mcl-1的表达与胃癌的发生发展有着重要的关系。研究表明，Mcl-1也可调节胃癌细胞的周期，影响胃癌细胞的凋亡[11]。但其与胃癌细胞侵袭转移关系的研究多在胃癌组织中进行。

本研究采用基因沉默技术抑制低分化胃癌细胞株MGC-803中Mcl-1基因的表达，观察胃癌细胞增殖、侵袭转移能力的变化及其对胃癌细胞凋亡和周期分布的影响。结果显示，Mcl-1 siRNA组转染后24 h、48 h、72 h的A值均低于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组，而空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组间无明显差异，提示抑制Mcl-1表达可以有效抑制胃癌细胞的增殖。Mcl-1 siRNA组转染后24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率分别为8.9%、21.6%和18.8%，以转染后48 h最高，但其是否与瞬时转染的不稳定性有关，有待稳定转染进一步检测。本研究结果显示，抑制Mcl-1的表达后，Mcl-1 siRNA组细胞凋亡率明显高于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组，且细胞周期以停滞在S期居多。这与Akagi等[11]的研究结果一致。

在本研究的侵袭、迁移实验中，Mcl-1 siRNA组穿膜细胞数低于空白对照组、脂质体对照组和阴性对照组，提示抑制Mcl-1基因的表达可以降低MGC-803细胞的侵袭、迁移能力。从细胞水平进一步证实了研究者们通过临床标本得出的Mcl-1与胃癌侵袭转移相关的结论，为明确Mcl-1与胃癌细胞侵袭、迁移能力之间的关系提供了更为直接有力的证据。但本实验只是应用脂质体介导的Mcl-1特异性siRNA的胃癌细胞的瞬时转染，抑制状态不够稳定；另外，未进行动物实验，无法明确其在体内的作用情况，故Mcl-1影响胃癌发展的作用机制有待于进一步研究。

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（2013-08-07收稿 2013-12-19修回）

（本文编辑 陈丽洁）

The Effect of Silencing Mcl-1 by siRNA on Biological Behavior of Gastric Cancer MGC-803 Cell

LIU Jinlu,WANG Zhen,CHEN Junqiang,CUI Xigang,MA Pengfei,LI Bopei
Department of Gas trointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021，China

Objective To investigate the effect of inhibiting Mcl-1 gene expression on the biological behavior of gastric cancer cell MGC-803 by using a small interference RNA(siRNA).MethodsSynthesized siRNA targeting Mcl-1(Mcl-1 siRNA group)was transfected into MGC-803 cells.On the other hand,MGC-803 cells transfected with negative siRNA (Mcl-1siRNA-NC group),MGC-803 cells transfected with Lipofectamine 2000（liposomes control group）and vacant MGC-803 cells（blank control group）were used as controls.Proliferation of MGC-803 cells after transfection of Mcl-1 siRNA was investigated by MTT assay.After 48 h transfection of Mcl-1 siRNA,flow cytometry(FCM)was used to examine the apoptosis cells and cell cycle in all four groups.Polycarbonate membrane transwell chamber was used for evaluating the invasion and migration of the cell line.ResultsThe absorbance of MGC-803 cells decreased greatly after transfected with Mcl-1siRNA for 24、48 and 72 h compared to those in control groups(P＜0.05);After transfected 48 h,apoptosis rate in Mcl-1siRNA group was higher than in the blank control group,liposomes control group and Mcl-1siRNA-NC group(%:19.61±1.66 vs 3.69±0.37 vs 3.54±0.47 vs 3.68±0.55,F=12.230,P＜0.05),G0/G1[(41.03±1.86)%]and G2/M phase ratio[(1.80±0.46)%] in Mcl-1 siRNA group were lower than in the three control groups,S phase ratio[(57.17±1.72)%]in siRNA group was higher than in three control groups(P＜0.05). The number of transmembrane cells in Mcl-1 siRNA group in polycarbonate membrane transwell chamber experiment(42.00±4.00,76.33±3.51 respectively)were less than in blank control group(79.33±3.51,108.00±3.61 respectively),liposome control group(74.67±2.52,110.67±4.04 respectively)and negative control group (77.33±3.06,109.33±4.51 respectively).However,there was no significant difference in above index among the control groups.ConclusionInhibitiing Mcl-1 expression can effectively suppress growth,invasion and migration,but promote apoptosis in gastric cancer cells.

stomach neoplasms;RNA,small interfering;cell proliferation;apoptosis;cell invasion;cell migration; siRNA;myeoid cell leukemin-1 gene

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.003

*广西自然科学基金资助项目(项目编号:桂科自0832113)；广西教育厅科研资助项目（项目编号：201012MS062）；广西卫生厅重点课题资助项目（项目编号：重2012067）；广西自然科学基金资助项目(项目编号:2012GXNSFDA239001)

广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科（邮编530021）

△通讯作者 E-mail:gxhans@163.com