诱导性多能干细胞疾病模型的应用价值

白 雪 王 毅

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）技术是生命科学研究和医学领域的一项突破性技术，在疾病研究、个体化治疗、再生医学及模型制备等方面均具有巨大的应用潜力[1]。Takahashi等[2]以逆转录病毒为载体，将4种干细胞转录因子（Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4）导入小鼠皮肤成纤维细胞，使细胞重编程为具有类似胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）特点的新型细胞，称为iPSC。Takahashi等[3]又利用4种同样的转录因子将人皮肤成纤维细胞诱导为iPSC。近年来，iPSC研究进展迅速，已获得了多种来源于人或动物成体细胞的iPSC，特别在iPSC疾病模型的研究方面，取得了重要的研究成果[4]。iPSC技术提供了一个忠实模拟人类疾病的机会，为人类疾病的研究奠定了基础。本文就iPSC疾病模型的应用价值综述如下。

1 iPSC疾病模型的优势

研究者常采用动物模型对疾病的病理机制和治疗药物进行研究。但动物与人类之间存在着生物学差异，许多人类疾病的状态无法用动物模型模拟，且构建的动物模型很难模拟疾病的个体差异。ESC诞生后，人们尝试着利用ESC的多潜能分化特性获得某种疾病的表型，但面临ESC的伦理问题及疾病表型不易诱发等难题。利用iPSC技术可直接从患者身上获得所需的研究材料，并且iPSC不受伦理的限制，细胞来源丰富。所获得的疾病iPSC及其分化的细胞可被广泛用于疾病的研究。iPSC疾病模型的研究已涉及神经系统、血液系统、心血管系统疾病及糖尿病、肝病和多种遗传性疾病等，研究内容包括：iPSC的诱导、分化、疾病表型、发病机制探索及药物试验等[5-6]。

目前，已有多种具有明确遗传背景的疾病建立了相应的iPSC疾病模型，一些特异性遗传性疾病相对容易模拟，更适于采用iPSC技术进行研究[7]。iPSC疾病模型为人们在体外研究疾病提供一个有效的平台[8]。

2 iPSC疾病模型的建立

iPSC疾病模型包括具有疾病表型的iPSC及其分化细胞，其建立的过程是患者的成体细胞重编程、诱导分化及筛选受疾病影响的效应细胞。重编程方法的发展为iPSC疾病模型的建立奠定了基础。成体细胞从去分化到重编程为iPSC一般需2~4周。iPSC诱导的本质是使终末分化的细胞重新获得多能干细胞相似的调控网络和表观遗传学特征，可通过外源性的转录因子、小分子化合物及人工激活的信号转导通路来实现。以逆转录病毒和慢病毒为载体，利用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4的重编程，可能会引起插入突变。Soldner等[9]利用Cre-Loxp系统重编程，在含有重编程基因的慢病毒载体两端加上loxp位点，随后载体整合进入成纤维细胞基因组中，重编程后，利用Cre基因的瞬时表达从iPSC中移除重编程因子。移除了重编程因子的iPSC基因表达谱与ESC更为接近，但Cre-Loxp系统重编程介导的基因删除会导致一段载体DNA留在插入位点上，也无法避免插入突变。Woltjen等[10]将重编程因子插入PiggyBac（PB）转座子的5′和3′末端重复序列之间，在转座酶的作用下，PB转座子整合进入成纤维细胞基因组。重编程以后，PB转座酶瞬时表达切除PB转座子，在整合位点不留任何痕迹。PB系统重编程较传统逆转录病毒方法产生iPSC的效率高，且安全。Cre-Loxp和PB系统重编程在操作上要求更多、更严格。

Zhou等[11]通过重编程因子的编码蛋白诱导iPSC形成，该研究将穿膜肽11R（11个精氨酸转导结构域）与4种转录因子蛋白相结合（Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和cMyc-11R），利用小分子物质丙戊酸（VPA）协助刺激，将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为iPSC。诱导过程不改变宿主细胞的基因组，安全性高，此方法简单，缺点是诱导效率低。Warren等[12]采用人工合成的mRNA诱导人体细胞重编程为iPSC，该方法避免了细胞对外源RNA的免疫反应，不损伤细胞的基因组，得到的iPSC与ESC更为相似，其诱导效率是传统方法的40~100倍，速度也是传统方法的2倍，是一种安全、有效的诱导方法，有较高的应用价值。Anokye-Danso等[13]首次采用小RNA（microRNAs）对人和鼠的成体细胞进行重编程，在未使用转录因子的情况下诱导出iPSC，并成功地分化为生殖细胞，诱导效率提高约100倍。随着iPSC技术的发展，安全性及诱导效率在不断提高，非病毒、非整合的诱导方法成为研究的热点，特别是iPSC安全性问题不但是iPSC临床应用的前提，也是成功建立iPSC疾病模型的保障。另外，建立iPSC疾病模型还需要有效的定向分化体系及分离纯化特定细胞类型的方法，以保证研究结果的准确性和可重复性。

3 iPSC疾病模型的应用

3.1 iPSC疾病模型与病理机制研究 马凡综合征（MFS）是一种遗传性结缔组织病，为常染色体显性遗传，由编码细胞外基质蛋白基因FIBRILLIN-1（FBN1）突变引起。MFS患者来源的iPSC能够像人ESC一样真实反映该基因疾病。来源于MFS患者的iPSC和来自于携带FBN1突变胚胎的ESC均具有FBN1基因突变，均表现出该疾病最为显著的临床特征：骨组织形成能力下降，容易形成软骨；并且证明转化生长因子（TGF）-β信号激活可导致FBN1突变的患者干细胞向骨的分化受到抑制，当抑制TGF-β信号时，干细胞向骨的分化得以恢复。利用患者的iPSC及其分化细胞在体外构建疾病模型，并进行疾病研究是完全可行的[14]。Ye等[15]将2例骨髓增殖性疾病（MPD）患者的外周血CD34+细胞转化为多个iPSC系，这些细胞携带MPD特征性的获得性的JAK2-V617F基因突变，并具有多向分化的能力。在一定条件下使其向造血细胞分化后，表现出红系造血能力增强和特定基因的表达，这类iPSC提供了研究MPD发病机制的模型。

关于帕金森病（PD）衰老机制，一直缺乏研究的模型，大多数PD研究利用转基因小鼠或药理学小鼠模型，而小鼠的神经生物学特征和衰老过程与人类具有很大的区别。Liu等[16]利用iPSC技术研究了携带PD致病基因LRRK2（G2019S）突变患者的神经细胞，首次揭示了核膜异常，以及脑内神经干细胞渐进性功能衰退在PD发生、发展中起重要作用。他们先将携带PD致病基因LRRK2（G2019S）突变的患者皮肤细胞诱导为iPSC，再将iPSC定向分化为目前无法从患者颅内直接获取的功能性神经干细胞及多巴胺神经元，发现LRRK2（G2019S）突变的神经干细胞表现出一系列与“衰老”相关的退行性表型，如对细胞内泛素化蛋白聚集诱导的凋亡更加敏感。随着体外传代次数的增加，携带基因突变的神经干细胞表现出明显的核膜异常，如核纤层蛋白组成和核膜结构的改变。为验证这些新型病理特征与PD致病基因LRRK2突变之间的分子联系，研究者通过基因打靶技术原位矫正了患者神经干细胞中的LRRK2（G2019S）突变。结果表明，矫正后的神经干细胞与PD相关的疾病表型消除了。相反，利用打靶技术在正常人ESC中定向敲入LRRK2(G2019S)突变，将会导致疾病相关表型的出现。

3.2 iPSC疾病模型与药物研究 药物研发中存在的难题是建立合适的模型。目前，最常使用动物模型，但动物模型不但涉及伦理问题，而且动物模型与人类存在遗传背景、生理及药物代谢差异等。利用iPSC疾病模型进行药物研究可避免上述限制，并且可针对不同患者建立iPSC疾病模型，筛选出具有针对性的药物，真正实现个体化治疗。

Riley-Day综合征是一种罕见的遗传病，其致病基因为IKBKAP，累及神经细胞，目前，人们很难通过组织学活检从患者体内取得这种细胞进行研究。Lee等[17]获得了Riley-Day综合征患者的皮肤细胞，将其诱导成为iPSC，再使iPSC分化为受到疾病影响的神经细胞（神经嵴前体细胞），构建了iPSC疾病模型，利用该模型进行了大规模的药物筛选。结果显示，这些化合物能提高IKBKAP的表达，其中SKF-86466能够通过调节细胞内PKA依赖的CREB磷酸化和cAMP水平来诱导IKBKAP转录，SKF-86466是在细胞水平上逆转疾病进程的潜在分子。由于一些罕见遗传疾病很难应用现有的模型进行药物研发，因此，该成果为一些遗传疾病提供了成本低、快捷的药物研发途径。

Tanaka等[18]报道，使用离子通道抑制剂作用于iPSC分化的心肌细胞，会引起该心肌细胞除极过程的改变，并呈剂量依赖性，与人体原位心肌细胞对离子通道抑制剂的反应一致。Yokoo等[19]研究表明，利用iPSC分化的心肌细胞进行药物研究具有可行性。Itzhaki等[20]获取了1例2型先天性QT间歇延长综合征（LQTS）患者的皮肤成纤维细胞，诱导生成了iPSC。该iPSC具有患者特异的KCNH2基因错义突变（A614V），将其分化为心肌细胞后，细胞表现出动作电位时程显著延长，原因是源于心脏外向钾电流显著下降。研究者应用该模型对一些治疗药物进行了评估。

利用iPSC分化的肝细胞可用于筛查药物的肝细胞毒性，有助于药物的评估。Takayama等[21]检测了与肝脏发育有关的7种候选基因。发现两种转录因子FOXA2及HNF1α可联合促进人iPSC及ESC分化为肝细胞。这些细胞具有肝细胞相关的基因表达谱，并且具备原代人类肝细胞的功能及特性。他们利用人iPSC及ESC分化的肝细胞成功地评估了9种药物引起的细胞毒性。FOXA2及HNF1α是促进人iPSC及ESC分化为肝细胞的有效转录因子，对筛查由药物引起的细胞毒性有重要价值。iPSC诱导和分化技术的发展，将促进iPSC疾病模型的完善和应用。

3.3 iPSC疾病模型与细胞治疗研究 iPSC疾病模型的建立为细胞治疗奠定了基础。人们可通过同源重组技术纠正患者iPSC中突变的基因，将其分化为功能细胞，回输到患者体内，有望彻底治愈疾病。Hanna等[22]第1次证实了基于iPSC的基因矫正可以修复遗传突变的表型，利用小鼠镰状细胞贫血的模型，他们建立了患病小鼠的iPSC，通过同源重组的技术矫正了具有缺陷的血红蛋白基因。这种经过基因矫正的小鼠iPSC具有体外分化为造血细胞的能力，这些造血细胞经过移植，使得患病小鼠的红细胞恢复正常功能。已有多种人类疾病特异的iPSC建立，且应用同源重组技术将致病基因修复，这些疾病模型包括：儿童早衰症、PD、回旋形萎缩症以及镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血和阵发性夜间血红蛋白尿等[23-25]。在这些研究中，部分iPSC细胞的治疗效果已在小鼠中得到验证[26]。

α1-抗胰蛋白酶（A1AT）基因的点突变（Glu342Lys），可导致患者α1-抗胰蛋白酶缺乏症（A1ATD），是肝脏和肺最常见的常染色体隐性遗传病，最终使患者罹患肝硬化和肺气肿。Yusa等[27]将A1ATD患者的皮肤细胞诱导为iPSC，再利用锌指核酸酶（ZFNs）剪断基因突变位置的基因序列，使用PB转座子将正确的基因插入其中，再将PB转座子序列从细胞中剔除，在基因修正点未发现DNA被破坏的现象。修正的人iPSC分化为肝脏细胞后，移植到肝功能失调的小鼠体内，证明这种经过修正的基因在其分化的肝脏细胞中非常活跃，能恢复小鼠的肝功能。尽管这些研究还处于初期阶段，但已向疾病的个性化治疗迈出了成功的一步。

β-地中海贫血是β-珠蛋白链合成减少或缺乏导致的一种溶血性遗传性疾病。其中重型β-地中海贫血常由β-珠蛋白基因发生点突变或小片段缺失造成。Wang等[28]研究了1例确诊为重型β-地中海贫血的患儿，其β-珠蛋白基因突变为纯合子β-41/42缺失，运用iPSC技术将患儿成体细胞诱导为十几株iPSC系，并对其中4株iPSC系进行多能性鉴定。通过同源重组技术修复了iPSC突变的位点，并将其分化为造血祖细胞，移植到免疫缺陷小鼠模型体内，该小鼠模型在放射性照射后，其红细胞及血红蛋白水平能较快恢复到正常水平，并产生出正常β-珠蛋白。iPSC技术结合基因打靶是潜在治疗遗传性疾病的手段。

另外，用于iPSC疾病模型的基因修复有两个方案，一是修复来源细胞的异常基因，以获得健康的iPSC及其分化细胞；或者修复iPSC异常基因，再获得基因正常的分化细胞。iPSC的基因修复为将来人类的细胞移植治疗奠定了基础。

4 iPSC疾病模型的局限性及解决方案

Soldner等[29]认为，单个iPSC系显示出高度差异的生物学特性，使人们难以预测它们分化为特异功能性细胞类型的倾向，限制了研究疾病特异性表型的价值。导致这些细胞间差异的原因大致分为3类：重编程过程造成细胞的改变；缺乏完善的分化实验方案导致培养诱导的差异；遗传背景的差异。如果将载体整合到宿主基因组中，则由重编程引起的细胞改变问题会更严重。因此，采用更先进的非整合性重编程技术，如质粒、mRNA转染及蛋白质转导。改善培养条件，执行更严格的质量控制，将能解决这些问题。

iPSC缺乏完善的体外分化方案，大部分方案均依赖于正常胚胎发育特殊阶段发挥重要作用的生长因子信号和调控因子。尽管这些方案较为有效，但它们通常生成的是不同细胞类型的混合物，当研究目标是构建高度受控的疾病模型时，这将是一个极大的限制。因此，导入受到谱系或细胞类型特异性启动子控制的报告基因或选择基因，可使研究者能够鉴别、筛选特异的细胞类型。另外，遗传变异对于基因表达的重要影响在个体间存在差异。当患者与健康供体间不具有相同的遗传背景或仅具有部分的遗传背景时，将患者来源的iPSC系与来自健康供体的iPSC系进行比较，以推测与疾病相关的表型时会有相当大的风险[29]。

[1]Teoh HK,Cheong SK.Induced pluripotent stem cells in research and therapy[J].Malays J Pathol,2012,34(1):1-13.

[2] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[3]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[4]Lan F,Lee AS,Liang P,et al.Abnormal calcium handling proper⁃ties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in pa⁃tient-specific induced pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell,2013,12(1):101-113.

[5]Liu GH,Qu J,Suzuki K,et al.Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2[J].Nature,2012,491(7425):603-607.

[6] Kim C,Wong J,Wen J,et al.Studying arrhythmogenic right ventric⁃ular dysplasia with patient-specific iPSCs[J].Nature,2013,494(7435):105-110.

[7] Nguyen HN,Byers B,Cord B,et al.LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress[J].Cell Stem Cell,2011,8(3):267-280.

[8] Egashira T,Yuasa S,Fukuda K.Novel insights into disease model⁃ing using induced pluripotent stem cells[J].Biol Pharm Bull,2013,36(2):182-188.

[9] Soldner F,Hockemeyer D,Beard C,Parkinson’s disease patientderived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J].Cell,2009,136(5):964-977.

[10]Woltjen K,Michael IP,Mohseni P,et al.PiggyBac transposition re⁃programs fibroblasts to induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,458(7239):766-770.

[11]Zhou H，Wu S，Joo JY，et al.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins[J].Cell Stem Cell,2009,4(5):381-384．

[12]Warren L,Manos PD,Ahfeldt T,et al.Highly efficient reprogram⁃ming to pluripo-tency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA[J].Cell Stem Cell,2010,7(5):618-630.

[13]Anokye-Danso F,Trivedi CM,Juhr D,et al.Highly efficient miR⁃NA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency[J].Cell Stem Cell,2011,8(4):376-388.

[14]Quarto N,Leonard B,Li S,et al.Skeletogenic phenotype of human Marfan embryonic stem cells faithfully phenocopied by patient-spe⁃cific induced-pluripotent stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(1):215-220.

[15]Ye Z，Zhan H，Mall P，et al.Human-induced pluripotent stem cells from blood cells of healthy donors and patients with acquired blood disorders[J].Blood,2009,114(27):5473-5480.

[16]Liu GH,Qu J,Suzuki K,et al.Progressive degeneration of human neural stem Cells caused by pathogenic LRRK2[J].Nature,2012,491(7425):603-607.

[17]Lee G,Ramirez CN,Kim H,et al.Large-scale screening using fa⁃milial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies com⁃pounds that rescue IKBKAP expression[J].Nat Biotechnol,2012,30(12):1244-1248.

[18]Tanaka T,Tohyama S,Murata M,et al.In vitro pharmacologic test⁃ing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyo⁃cytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,385(4):497-502.

[19]Yokoo N,Baba S,Kaichi S,et al.The effects of cardioactive drugs on cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,387(3):482-488.

[20]Itzhaki I,Maizels L,Huber I,et al.Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells[J].Nature，2011,471(7337):225-229.

[21]Takayama K,Inamura M,Kawabata K,et al.Generation of metaboli⁃cally functioning hepatocytes from human pluripotent stem cells by FOXA2 and HNF1α transduction[J].J Hepatol,2012,57(3):628-636.

[22]Hanna J,Wernig M,Markoulaki S,et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J].Science,2007,318(5858):1920-1923.

[23]Liu GH,Barkho BZ,Ruiz S,et al.Recapitulation of premature age⁃ing with iPSCs from Hutchinson-Gilford progeria syndrome[J].Na⁃ture,2011,472(7342):221-225.

[24]Soldner F,Laganiere J,Cheng AW,et al.Generation of isogenic plu⁃ripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations[J].Cell,2011,146(2):318-331.

[25]Sebastiano V,Maeder ML,Angstman JF,et al.In situ genetic correc⁃tion of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripo⁃tent stem cells using engineered zinc finger nucleases[J].Stem Cells,2011,29(11):1717-1726.

[26]Hargus G,Cooper O,Deleidi M,et al.Differentiated Parkinson pa⁃tient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult ro⁃dent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(36):15921-15926.

[27]Yusa K,Rashid ST,Strick-Marchand H,et al.Targeted gene correc⁃tion of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells[J].Nature,2011,478(7369):391-394.

[28]Wang Y,Zheng CG,Jiang Y,et al.Genetic correction of β-thalasse⁃mia patient-specific iPS cells and its use in improving hemoglobin production in irradiated SCID mice[J].Cell Res,2012,22(4):637-648.

[29]Soldner F,Jaenisch R.Medicine.iPSC disease modeling[J].Sci⁃ence,2012,338(6111):1155-1156.