纤维支气管镜活检组织Sox2基因对肺癌的诊断价值*

李劳冬 莫碧文△ 于会娜 王昌明 曾锦荣 王绩英 李党育

纤维支气管镜活检组织Sox2基因对肺癌的诊断价值*

李劳冬1莫碧文1△于会娜2王昌明1曾锦荣1王绩英1李党育3

目的 探讨纤维支气管镜活检组织标本中干细胞标志物Sox2 mRNA对肺癌的诊断价值。方法采用RT-PCR技术检测100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纤维支气管镜活检标本中Sox2 mRNA的表达，随后利用免疫组化技术验证Sox2蛋白在50例肺癌组织、32例良性病变肺组织和18例癌旁正常肺组织间表达的差异，分析Sox2 mRNA表达与肺癌临床病理参数的关系及其在肺癌诊断中的潜在价值。结果Sox2 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达量显著高于非癌肺组织（P＜0.05）。肺癌患者不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移，Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义。Sox2 mRNA ROC曲线下面积为0.748，临界值取0.513时，其灵敏度和特异度分别为85.0%和61.1%。结论纤维支气管镜活检组织标本Sox2 mRNA可能是肺癌诊断的有效标志物。

肺肿瘤；支气管镜检查；肿瘤干细胞；肿瘤标记，生物学；免疫组织化学；Sox2基因

Sox2是性别决定区Y框架蛋白(SRY-related HMG-box genes,Sox)家族中的重要一员，是胚胎干细胞维持其多潜能性的重要转录因子，在胚胎发育的各阶段中都起着关键性作用。研究表明，Sox2不仅在胚胎干细胞中表达，在乳腺癌、胶质母细胞瘤、胰腺癌、食管癌、肺癌等人类原发性肿瘤中也高表达，且与肿瘤的发生发展、浸润和转移关系密切，是潜在的肿瘤诊断标志物、治疗靶点和预后标志物[1]。纤维支气管镜检查是目前临床诊断肺癌的常规方法。然而，纤维支气管镜活检组织中的Sox2 mRNA在肺癌中的诊断价值，及Sox2 mRNA的检测可否辅助纤维支气管镜检查目前国内外尚少见报道。本研究通过检测Sox2 mRNA和Sox2蛋白在肺癌和良性肺病变组织中的表达差异，探讨纤维支气管镜活检组织Sox2 mRNA在肺癌诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2011年1月—2012年1月桂林医学院附属医院和附属南溪山医院临床病理资料完整的肺癌患者纤维支气管镜活检标本100例。其中90例经纤维支气管镜活检病理确诊为肺癌，另10例纤维支气管镜活检标本并未见癌细胞，但经肺穿刺、手术切除或纤维支气管镜刷片病理确诊为肺癌。其中男84例，女16例，年龄29～80岁，平均（59.0±10.5）岁。非小细胞肺癌66例，其中鳞癌50例，腺癌16例；小细胞肺癌24例；其他类型肺癌10例。根据2009年UICC肺癌TNM分期标准，Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期60例，Ⅳ期27例，其中85例有淋巴结转移，15例无淋巴结转移。收集同期良性肺疾病患者纤维支气管镜活检标本18例，均无肿瘤证据，肺泡灌洗找到抗酸杆菌，经抗感染（或抗结核）及对症治疗后临床症状消失，胸片或肺部CT示病灶明显吸收而确诊为良性病变。其中支气管炎7例，肺结核6例，肺炎3例，支气管内膜结核1例，支气管扩张1例。男14例，女4例，年龄23～73岁，平均（56.9±12.4）岁。2组间性别（χ2=0.094）、年龄（t=0.749）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。另收集桂林医学院附属医院2002年1月—2012年12月病史资料完整的肺癌手术切除石蜡标本50例，癌旁正常肺组织18例和良性病变肺组织32例行免疫组化检测。肺癌组织中男38例，女12例；年龄34～76岁，平均（55.0±8.8）岁。小细胞肺癌7例，非小细胞肺癌43例，其中鳞癌23例，腺癌17例，支气管肺泡细胞癌3例。癌旁正常肺组织中男12例，女6例；年龄48～73岁，平均（56.7±6.4）岁。良性病变肺组织中男23例，女9例；年龄23～72岁，平均（51.5±11.4）岁。3组间性别（χ2=0.734）、年龄（F=2.352）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者术前均未行放、化疗，且术前均经纤维支气管镜活检。本研究通过桂林医学院伦理委员会审核，术前均告知患者本检查的目的和取材方式，获得患者的同意并签知情同意书。

1.2 主要试剂 Sox2（319 bp）引物：上游5′-GCT AGT CTC CAA GCG ACG AA-3′和下游5′-TAC AGT CTA AAA CTT TTG CCC TT-3′；内参β-actin（417 bp）引物：上游5′-ACA GAG CCT CGC CTT TGC CGATC-3′，下游5′-TGG GTC ATC TTC TCG CGG TTG G-3′；均由上海invitrogen公司合成。Trizol总RNA抽提试剂盒和逆转录试剂盒均购自TaKaRa公司。免疫组化试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥，鼠抗人Sox2单克隆抗体购自美国ProMab生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR检测Sox2 mRNA的表达 活检组织用DEPC水冲洗，置冻存管，立即放入液氮罐冷冻，再移至-80℃冰箱保存待用。取出纤维支气管镜活检冻存标本，在超净工作台内，严格按照Trizol说明书提取RNA；按照逆转录酶使用说明将样本mRNA逆转录成cDNA，随后进入PCR扩增；反应体系（25 μL）：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×Mix 12.5 μL，加入RNase-free水至25 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56.2℃退火30 s（β-actin退火温度为60.2℃），72℃延伸45 s，共35个循环，最后72℃延伸2 min。配1.5%～2%琼脂糖凝胶，取目的基因PCR产物6 μL和内参PCR产物6 μL混匀后跑电泳，用JS-780凝胶成像系统对条带进行灰度分析，将每个标本内参设为1，以Sox2 mRNA条带灰度值与其内参（β-actin）条带灰度值之比作为每例标本Sox2 mRNA的表达量。

1.3.2 免疫组化检测Sox2蛋白的表达 免疫组化染色严格按照PV-9000二步法免疫组化试剂盒说明操作。抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液（0.01 mol/L pH6.0）高温高压修复，一抗稀释浓度为1∶800。每批实验均采用已知Sox2阳性的肺鳞癌组织切片为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。结果判断：镜下随机读取10个不重叠的高倍（400倍）视野，大约1 000个细胞被观察分析。Sox2蛋白的表达依据阳性细胞率及阳性强度综合计算其表达量。阳性率评分标准：阴性，0分；1%～30%阳性细胞，1分；31%～60%阳性细胞，2分；60%以上阳性细胞，3分。阳性强度评分标准：阴性，0分；淡黄色，1分；黄色或棕褐色，2分；深棕色，3分。阳性表达水平得分=阳性比例得分×阳性强度得分，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～6分为中度阳性（++），7～9分为强阳性表达（+++）。所有切片均由一位病理科医师和一位训练良好的研究者在不了解患者临床资料的情况下独立观察判断，对独立判断不一致的病例再共同进行观察判定。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。正态分布计量资料以s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。不符合正态分布或方差不齐时以M(P25,P75)表示，采用非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。计数资料以例（%）表示，行χ2检验。通过ROC曲线来评价Sox2 mRNA在肺癌中的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sox2 mRNA的表达 Sox2 mRNA在肺癌纤维支气管镜活检组织中的阳性率为98%(98/100)，在良性肺病变的阳性率为83.3%(15/18)，差异有统计学意义（χ2=4.876，P＜0.05）。纤维支气管镜活检肺癌组织Sox2 mRNA的灰度值为1.450(0.859,2.479)，良性肺病变组织为0.385(0.006,1.172)，差异有统计学意义（U=454.5，P=0.001）。

2.2 Sox2 mRNA的表达与肺癌临床病理参数的关系 肺癌患者不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移，Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 Sox2 mRNA在肺癌中的诊断价值 采用ROC曲线评价Sox2 mRNA对肺癌的诊断价值，Sox2 mRNA曲线下的面积为0.748，见图1。临界值取0.513时，其灵敏度和特异度分别为85.0%和61.1%。10例纤维支气管镜活检病理检查未见癌细胞的肺癌患者，其纤维支气管镜活检标本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。

2.4 Sox2蛋白的表达 Sox2阳性蛋白颗粒主要定位于胞核，在所有正常肺组织和良性病变肺组织的支气管上皮、鳞状化生上皮均呈阳性表达，在肺泡上皮呈阴性表达。Sox2在肺癌中的表达水平显著高于正常肺组织（U=207.0）和良性病变肺组织（U=426.5），差异有统计学意义（P＜0.01），见表2、图2。

3 讨论

随着环境污染加重和人口老龄化程度加重，肺癌的发病率在我国呈不断上升趋势。尽管近几十年来肺癌患者的预后有所改善，但其5年生存率只有16%[2]。早期诊断、早期手术切除是提高肺癌患者生存率的关键。纤维支气管镜检查是肺癌诊断的常用检查方法，包括纤维支气管镜钳取活检、纤维支气管镜细胞刷片和肺泡灌洗等。即使常规的纤维支气管镜检查联合运用，其诊断肺癌的敏感度也只有90%[3]。近来，Maldonado等[4]认为，通过先进的分子技术可辅助常规的纤维支气管镜标本病理诊断，从而筛查和早期诊断肺癌。

Sox2是胚胎干细胞维持其多潜能性的重要转录因子，在维持食管、支气管的正常发育及神经干细胞、肺支气管基底细胞的干细胞特性方面发挥着重要作用，是重要的干细胞标志物。Sanada等[5]研究发现，Sox2在胰腺导管内瘤变、原位癌和浸润性导管癌中的表达呈逐渐增加的趋势，且其高表达在低分化胰腺癌和血管浸润性胰腺癌中更明显，提示Sox2可能参与了胰腺癌的发生发展、浸润和转移。最近，有报道称Sox2在胃癌中的阳性表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移显著相关，是判断胃癌患者预后不佳的标志物[6]。另有研究发现，沉默Sox2可显著抑制胶质脑细胞瘤的细胞克隆增殖能力和体内成瘤能力，Sox2是治疗胶质脑细胞瘤有效的作用靶点[7]。Lu等[8]观察到Sox2在人类原发性肺鳞癌和部分肺腺癌中高表达，Sox2的高表达可诱导远端气道产生近端气道样化生并引起肿瘤，Sox2的高表达参与了肺癌的发生发展。Chapman等[9]则发现，检测血液标本中的Sox2自身抗体是诊断小细胞肺癌的有效指标，有助于对小细胞肺癌高危人群进行早期诊断。

本研究显示Sox2 mRNA和蛋白在肺癌中的表达显著高于非癌肺组织，提示Sox2基因在肺癌组织中表达上调，可能在肺癌发生、发展中起重要作用。利用免疫组化技术，笔者观察到Sox2蛋白在非癌肺组织中主要表达于支气管上皮细胞和鳞状化生支气管上皮细胞，与以往研究结果相符[8,10]。这些Sox2阳性的支气管上皮细胞可能通过恶性突变参与了肺癌的发生、发展。一般认为，Sox2在肺癌中的表达与组织类型有关，Sox2在肺鳞癌中的表达显著高于肺腺癌。本研究发现，不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移肺癌患者，Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义。这可能与纤维支气管镜活检标本的异质性有关，由于纤维支气管镜活检标本体积小，癌细胞比例低及标本中包含或多或少的支气管上皮细胞和鳞状化生上皮细胞，从而干扰了Sox2 mRNA在肺癌患者纤维支气管镜活检组织中的表达与肺癌的临床病理参数的关系。笔者发现ROC曲线下的面积为0.748，提示其在肺癌中具有较高的诊断价值。此外，本研究10例纤维支气管镜活检病理检查假阴性的肺癌患者，其纤维支气管镜活检标本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。提示此种情况，即使纤维支气管镜活检常规病理检查未见癌细胞，仍高度怀疑为肺癌，必要时需行肺穿刺活检或手术切除肺活检明确诊断。检测纤维支气管镜活检组织标本Sox2 mRNA的表达或许可辅助常规纤维支气管镜检查。而可否通过检测纤维支气管镜细胞刷片或肺泡灌洗液或血液标本中Sox2 mRNA的表达来筛查和早期诊断肺癌需进一步研究予证实。

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（2013-06-19收稿 2013-10-27修回）

（本文编辑 魏杰）

The Diagnostic Value of Sox2 mRNA Transcription Level in Bronchoscopy Biopsy Specimens in Lung Cancer

LI Laodong1,MO Biwen1,YU Huina2,WANG Changming1,ZENG Jinrong1,WANG Jiying1,LI Dangyu3
1 Department of Respiratory Medicine,Hospital Affiliated Guilin Medical College,Guilin 541001,China;2 Department of Pediatrics,Jingzhou Central Hospital of Hubei Province;3 Department of Respiratory Medicine,Nan Xi Shan Hospital

ObjectiveTo study the diagnostic value of Sox2 mRNA transcription level in bronchoscopic biopsy specimens from lung cancer patients.MethodsThe expression of Sox2 mRNA was detected using RT-PCR from 100 human lung cancer biopsy and 18 non-cancer lung biopsy through bronchoscopy.The expression of Sox2 protein was examined by immunohistochemistry from 50 cases of lung cancer biopsy,32 cases of benign lung lesions and 18 cases of pericarcinomatous normal lung tissues.Then the relationships between Sox2 mRNA transcription level and lung cancer clinical pathological parameters were analyzed to test the diagnostic value of Sox2 transcription level.ResultsThe transcription of Sox2 mRNA and its protein expression level were significantly higher in lung cancer than that in benign pulmonary disease tissues（P＜0.05）.The transcription of Sox2 mRNA was not correlated with age,gender,histology,lymph node metastasis,TNM stage and differentiation of lung cancer patients(P＞0.05).The Sox2 mRNA yielded an area of 0.748 under the ROC curve with the sensitivity of 85.0%and the specificity of 61.1%,taking the cut-off value of 0.513.ConclusionThe Sox2 mRNA might be a useful diagnostic marker for lung cancer.

lung neoplasm;bronchoscopy;neoplastic stem cells;tumor markers,biological;immunohistochemistry; Sox2 gene

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.004

*广西卫生厅重点科研项目（项目编号：重2012003，重2011008，重2010046）

1桂林医学院附属医院呼吸内科（邮编541001）；2荆州市中心医院儿科；3南溪山医院呼吸内科

△通讯作者 E-mail:mobiwen2002@sohu.com