人胰岛素原基因突变导致糖尿病机制的实验研究*

张红艳 崔景秋 李 宁 刘 铭 冯 凭

人胰岛素原基因突变导致糖尿病机制的实验研究*

张红艳 崔景秋△李 宁 刘 铭 冯 凭

目的 构建几种与人类糖尿病相关的人突变型胰岛素原质粒，并在大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1）中进行表达。方法以野生型人胰岛素原质粒基因PCMS-EGFP/HWT为模板，设计并合成引物，利用定点突变技术，PCR生成PCMS-EGFP/H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C、H-F(B25)L 4种单点突变质粒，对每个质粒进行序列测定验证定点突变成功，用脂质体2000将上述野生型、4种突变型质粒及空质粒分别转染INS-1细胞，放射免疫法检测各细胞培养液中人胰岛素水平。结果序列测定证实上述质粒定点突变成功,H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3组突变细胞培养液中胰岛素水平低于野生型和H-F(B25)L组（P＜0.05），与空质粒组差异无统计学意义，且3组彼此间差异无统计学意义；H-F(B25)L组与野生型差异无统计学意义（P＞0.05）。结论成功构建并表达4种突变型人胰岛素原质粒，不同突变型胰岛素原可能通过不同机制导致糖尿病。

诱变,定点；质粒；转染；内质网应激；永久性新生儿糖尿病；胰岛素原错误折叠；β细胞功能衰竭

胰岛素病是指由胰岛素编码序列中的单基因突变所引起的一系列严重的常染色体显性遗传性疾病。其中大多数胰岛素病患者对外源胰岛素很敏感，具体机制尚不清楚，临床诊断中常常隐匿在1B型糖尿病（抗体阴性）、青少年发病的成年型糖尿病（MODY）及非肥胖的早发2型糖尿病中[1]。由于不同胰岛素基因突变引起的临床特征及其对胰岛素分泌水平的影响不同，目前研究认为不同类型的突变可能是通过不同的机制导致糖尿病的发生。本实验通过定点突变技术（site-directed mutagenesis）构建3种导致永久性新生儿糖尿病（permanent neonatal diabetes mellitus，PND）以及1种导致成年发病的突变型人胰岛素原质粒，在大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1）中成功表达，并检测各自细胞培养液中的胰岛素水平，旨在探索单基因突变导致的糖尿病发病的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PCMS-EGFP/HWT质粒为本课题组刘铭教授构建保存；INS-1细胞由天津市心血管病研究所惠赠（购自中科院细胞库）。高纯度质粒中量提取试剂盒Plasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；定点突变试剂盒购自北京全式金公司；引物由奥科生物有限公司合成；脂质体2000购自Invitrogen公司。人胰岛素放免试剂盒购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶链反应（PCR）扩增突变型胰岛素原 以野生型胰岛素原质粒基因PCMS-EGFP/HWT为模板，应用定点突变试剂盒进行PCR，突变位点分别为B19位氨基酸由C突变为G，B11位氨基酸由L突变为P，S6位氨基酸由R突变为C，B25位氨基酸由F突变为L，分别针对4个突变位点设计引物并合成。PCR反应体系如下：5×Buffer 10 μL，质粒模板DNA 1 μL（6 ng），10 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物各1 μL（80 mg/L），DNA聚合酶1 μL补水至50 μL，瞬时离心混匀，循环参数为94℃4 min，后94℃30 s，55℃30 s，72℃150 s，25个循环，72℃10 min。PCR产物DMT酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对PCR产物进行序列测定，见表1、2。

1.2.2 INS-1细胞培养及突变质粒转染 INS-1细胞培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640（含0.11 g/L L-谷胱甘肽+ 0.11 g/L丙酮酸钠+5.6 mmol/L葡萄糖+1 mL/L 2-巯基乙醇），将细胞转入6孔板并置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。用脂质体2000将突变型胰岛素原质粒、野生型质粒及空质粒PCMC-EGFP分别转染INS-1细胞，各质粒和脂质体2000比例为每孔2 μg∶3 μL。转染48 h后，观察细胞形态，并收集细胞培养液，-20℃冻存。

1.2.3 人胰岛素水平的检测 分别将空质粒对照、野生型胰岛素原质粒、突变型胰岛素原质粒转染INS-1细胞，48 h后收集细胞培养液，应用放射免疫法检测人胰岛素水平，试剂盒购自Millipore公司，与鼠胰岛素无交叉反应，不识别内源性的大鼠胰岛素。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用±s表示，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 点突变质粒的鉴定 琼脂糖凝胶电泳结果显示，与野生型胰岛素原质粒一致，4种点突变质粒均于5.7 kb处可见清晰条带，见图1。分别对4种突变型质粒进行序列测定，并与野生型胰岛素原质粒序列对比，突变位置正确。

2.2 INS-1细胞转染结果 转染48 h后可见INS-1细胞贴壁生长，形态基本正常，状态良好。转染24 h后细胞内出现绿荧光蛋白（GFP）颗粒，48 h后细胞中GFP表达呈片状，表明转染成功，各组转染效率接近，见图2。

2.3 INS-1细胞培养液中人胰岛素水平检测结果 H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C 3组突变细胞培养液中胰岛素水平低于野生型和H-F(B25)L组（P＜0.05），与空质粒组差异无统计学意义，且3组彼此间差异无统计学意义；H-F(B25)L组与野生型差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

3.1 胰岛素基因突变型糖尿病研究现状 根据临床特征将胰岛素病分为青少年型糖尿病（MIDY），以及成年发病型糖尿病。其中MIDY是一种新型的单基因突变型糖尿病[2]。已经发现的与MIDY有关的胰岛素基因突变有26个，其中22个突变都会导致严重的胰岛素缺乏性糖尿病。MIDY突变已经被认为是PND的常见病因[3]，突变位置包括半胱氨酸、非半胱氨酸（包含信号肽），不同位置突变导致糖尿病发病年龄和病情轻重不同，因此推测发病机制可能不同。

Table 3 Comparison of human insulin values in culture solution表3 各组细胞培养液中人胰岛素水平比较（mIU/L±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，P＜0.05

组别PCMS-EGFP/H-F(B25)L（1）PCMS-EGFP/HWT（2）PCMS-EGFP/H-C(B19)G（3）PCMS-EGFP/H-L(B11)P（4）PCMS-EGFP/H-R(S6)C（5）PCMS-EGFP空质粒（6）F n666666胰岛素值23.41±0.99 23.74±1.20 4.72±0.05ab4.71±0.16ab4.59±0.31ab4.61±0.24ab1 322.002＊＊

3.2 半胱氨酸突变导致糖尿病机制分析 本研究中H-C(B19)G突变是B链19位由半胱氨酸突变为甘氨酸，突变可能影响了B19-A20分子内二硫键的形成，造成胰岛素原错误折叠，影响胰岛素原的转运、加工和分泌，因此其细胞培养液中胰岛素水平明显降低。同时大量错误折叠的胰岛素原在内质网堆积，引发内质网应激（endoplastic reticulum stress，ESR）和胰岛β细胞的凋亡。国外研究也证实C(A7) Y、C(B19)G、S(A12)C、G(B8)S、H-C(B19)G等突变影响二硫键的形成，患者多在新生儿期发病，表现为严重的胰岛素依赖性糖尿病，此类突变改变了胰岛素原肽链上半胱氨酸残基的数量，影响胰岛素原分子内部正常二硫键的形成[4]。对胰岛素原分子动力学的研究也提示，在还原条件下，胰岛素原二硫键打开，造成B链中心螺旋稳定性破坏，胰岛素原整体空间构象改变，生物活性受损[5]。

3.3 非半胱氨酸突变导致糖尿病机制分析 H-L (B11)P为非半胱氨酸突变，此类突变没有改变半胱氨酸残基的数量，但它们在胰岛素原分子中的定位对于二硫键的正确配对以及维持二硫键的稳定至关重要，突变造成胰岛素原的错误折叠，因此分泌到细胞培养液中的胰岛素明显低于野生型。H-R(S6)C/ H突变在小鼠胰岛β细胞瘤（MIN6）细胞中的研究提示，突变造成轻微的ERS，对胰岛素原的靶向胞吐作用影响不大，临床发病年龄较晚，病情较轻，常误诊断为MODY[6]。本研究中H-R(S6)C突变后细胞培养液中胰岛素水平减低，提示突变后胰岛素未被转运出内质网，原因可能是突变影响了信号肽的剪切，继而影响了下一步的正确折叠。Liu等[7]研究证实，同为信号肽位置突变，A(S23)S突变并未影响信号肽剪切，而A(S24)D突变造成剪切位点改变，错误剪切的胰岛素原大量堆积在内质网，引起ERS。2013年最新报道的L(S13)R突变，定位研究显示此突变位于胰岛素原信号肽的疏水核心区域，即剪切的活性位点，造成错误剪切，引起胰岛素依赖性PND[8]。这些研究证实，部分非半胱氨酸突变同样可以导致MIDY。

本研究中上述3种基因突变其细胞培养液中胰岛素原水平均与空质粒相近，而低于野生型胰岛素基因，提示任何原因所致的胰岛素原错误折叠都将阻断其从内质网至下游通路的转运，从而导致胰岛素合成减少。

3.4 导致成年发病的F(B25)L突变机制分析 本实验中F(B25)L突变细胞培养液中人胰岛素原水平与野生型差异无统计学意义，提示此类型突变可能不影响胰岛素原的折叠、转运、加工和分泌，而主要通过影响胰岛素与胰岛素受体的结合，导致其生物活性的降低，引发糖尿病。

3.5 研究意义 虽然由胰岛素基因突变所致的糖尿病在整个糖尿病人群中仅占很少的部分，但是由于不同胰岛素原基因突变导致糖尿病的发病年龄、血糖水平及胰岛素依赖程度不同，提示在PND、1B型糖尿病、部分MODY以及非肥胖2型糖尿病患者中筛查胰岛素原突变基因，将有助于临床治疗策略的制定。对于不同突变胰岛素原分子结构和分泌通路的进一步研究，将有助于更好地理解其他更常见原因，如胰岛素抵抗型2型糖尿病等所引起的由胰岛素原错误折叠、ERS导致的胰岛β细胞功能衰竭的病理机制，为开发可能纠正胰岛素原错误折叠、改善ERS的治疗提供新策略和必要的理论基础。

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（2014-01-20收稿 2014-02-25修回）

（本文编辑 李鹏）

Study of Mechanism of Proinsulin Gene Mutations in Diabetes Mellitus

ZHANG Hongyan,CUI Jingqiu,LI Ning,LIU Ming,FENG Ping
Department of Metablism,Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

ObjectiveTo construct several human proinsulin mutants plasmid related to diabetes and to express in INS-1(Insulin secreting beta cell derived line)cell.MethodsHuman mild proinsulin gene was used as template,and site-directed mutagenesis PCR was employed to generate four human proinsulin plasmid mutants.Each mutant plasmid was sequenced then transfected with empty plasmid and mild plasmid into INS-1 cell by liposome 2000.Insulin value in each cell solution was determined by radioimmunoassay.ResultsProinsulin mutants plasmid were confirmed by sequencing.Insulin values in culture solution of H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C mutants are less than those in wild type and H-F (B25)L（P＜0.05）.Comparison of insulin values between H-C(B19)G、H-L(B11)P、H-R(S6)C groups were not statistically significant（P＞0.05）,and all these three groups showed no significant differences with empty plasmid group statistically（P＞0.05）.Insulin value of H-F(B25)L was of no significant differences statistically with empty plasmid（P＞0.05）.ConclusionFour human proinsulin mutants plasmid were constructed and expressed successfully in INS-1 cell,and different mutants plasmid result in diabetes through different mechanism.

mutagenesis,site-directed；plasmids；transfection；endoplastic reticulum stress；permanent neonatal diabetes mellitus；proinsulin misfolding；β cell failure

R587.1，R349.64

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.002

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：81070629）；天津市应用及前沿技术研究计划项目（项目编号：11JCZDJC18500）

天津医科大学总医院代谢病科（邮编300052）

△通讯作者 E-mail：cuijingqiu@sina.com