周细胞在子宫内膜异位症血管生成中的作用

赵采云 尹利荣 孙俊杰

周细胞在子宫内膜异位症血管生成中的作用

赵采云 尹利荣△孙俊杰

目的 探讨周细胞在子宫内膜异位症（EMs）血管生成中的作用。方法采用免疫组化方法（SP法）检测60例EMs患者（EMs组）在位内膜（增殖期、分泌期内膜各20例）、异位内膜20例及40例非子宫内膜异位症患者（对照组）子宫内膜（增殖期、分泌期各20例），分别选用平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）标记平均周细胞数（PN）和CD34标记微血管密度（MVD），并对二者比值（PN/MVD）进行比较，分析周细胞与EMs血管生成之间的关系。结果EMs组异位内膜MVD高于正常增殖期和正常分泌期内膜（P＜0.05），在位内膜增殖期、分泌期的MVD与相应的正常内膜比较差异均无统计学意义，在位内膜及正常内膜组内比较均为分泌期高于增殖期（P＜0.05）。EMs组异位内膜PN低于正常增殖期内膜（P＜0.05），与正常分泌期内膜相比差异无统计学意义，在位内膜增殖期、分泌期的PN与相应的正常内膜相比差异均无统计学意义，组内比较均分泌期低于增殖期（P＜0.05）；EMs组异位内膜的PN/MVD低于正常增殖期和正常分泌期内膜（P＜0.05）。在位内膜无论增殖期还是分泌期的PN/MVD与相应的正常内膜比较，均为在位内膜低于正常内膜（P＜0.05），组内比较均分泌期低于增殖期（P＜0.05）。结论周细胞对EMs血管生成起着重要作用，周细胞覆盖率是判定子宫内膜血管成熟度和稳定性的重要指标。

子宫内膜异位症；新生血管化,生理性；周细胞；免疫组织化学；微血管密度；血管生成

子宫内膜异位症（EMs）是育龄期妇女的常见病、多发病，虽是良性疾病，却具有种植、侵袭、转移等恶性生物学行为，有“良性癌”之称。EMs的发生、发展及消退等过程高度依赖血管生成。大量关于血管生成的研究证实，周细胞在生理和病理性血管生成中起着重要的作用，周细胞不仅作为新生血管的重要组成部分参与血管生成，还具有调节血管成熟、稳定的功能[1-3]。本研究采用免疫组织化学法（SP法）对异位、在位及正常子宫内膜中微血管密度（MVD）和平均周细胞数（PN）进行检测，并对两者的比值（PN/MVD）进行分析，以探讨周细胞在EMs血管生成中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年7月—2013年7月在我院妇科接受卵巢EMs病灶切除术或附件切除术，且术后病理检查证实为卵巢EMs的患者60例作为研究组，年龄24～48岁，平均（34.0±7.4）岁，异位内膜20例，在位内膜40例（其中增殖期、分泌期内膜各20例）。选取同期因子宫平滑肌瘤行手术治疗的患者40例作为正常对照组，经术后病理证实为正常子宫内膜，排除子宫内膜异位症及子宫内膜疾病，年龄28～50岁，平均（37.3±7.8）岁，其中正常增殖期、正常分泌期内膜各20例。所有患者月经周期规律，无妇科内分泌疾病、生殖系统肿瘤及感染，手术前6个月未接受激素治疗、无妊娠及哺乳史。标本采集均经患者知情同意。

1.2 主要试剂及方法 鼠抗人原始造血细胞CD34单克隆抗体、即用型鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体以及即用型SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有标本均经10%福尔马林固定，常规脱水至石蜡包埋,行4～5 μm厚切片，烤片后行HE染色，经病理医师确诊为研究所需内膜，后行免疫组化染色。抗原修复使用高温修复法，具体步骤严格按试剂盒说明书操作，DAB显色，经苏木素复染、封片、观察，检测子宫内膜组织中CD34、平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）的表达。已知胰腺癌组织作为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。

1.3 检测指标的定性与定量 切片分别于低倍镜和高倍镜下观察，抗体抗原阳性反应呈棕黄色，且染色明显高于背景，CD34为内皮细胞胞膜阳性，SMA为周细胞胞浆阳性。MVD计数：首先在×100视野下选择计数部位，然后在×400视野下计数CD34阳性的微血管数，单个内皮细胞作为1个计数单位，不论是否形成管腔或管腔内有无红细胞，残存血管或血管腔直径＞8个红细胞者不计数，每例分别读取5个不重复的视野计数，然后计算单位视野（×400）的平均值，即为MVD。PN计数：首先在×100视野下选择计数部位，在×400视野下计数微血管SMA阳性的周细胞数，每例分别选取5个不重复的视野计数，计算单位视野的平均值，即为PN。

1.4 统计学方法 使用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用±s表示，均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tamhane’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异位内膜、在位内膜、正常内膜中MVD的比较 正常内膜、在位内膜、异位内膜相比较，CD34阳性的内皮细胞数呈逐渐增加趋势，且同正常内膜相比，异位内膜内由单个内皮细胞组成、未形成管腔或直径较小的微血管明显增加，见图1。各组内膜MVD定量结果显示：异位内膜高于正常增殖期和正常分泌期内膜（P＜0.05）；在位内膜无论增殖期还是分泌期与相应的正常内膜相比差异均无统计学意义；在位内膜分泌期高于增殖期，正常内膜分泌期高于增殖期（P＜0.05），见表1。

Table 1 Comparison of MVD、PN and PN/MVD level in endometrium between different groups表1 各组内膜MVD、PN及PN/MVD水平比较（n=20，±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）比较，b与（2）比较，c与（3）比较，d与（4）比较，P＜0.05

组别异位内膜（1）在位增殖期（2）在位分泌期（3）正常增殖期（4）正常分泌期（5）F MVD（条/HP）47.25±2.69 23.00±1.72 33.50±2.91b22.05±1.28a33.35±2.70ad377.36＊＊PN（个/HP）14.50±1.47 24.95±2.28 14.55±1.32b26.75±3.26a15.45±1.10d176.61＊＊PN/MVD 0.31±0.03 1.08±0.05 0.44±0.03b1.21±0.14ab0.46±0.03acd710.29＊＊

2.2 异位内膜、在位内膜、正常内膜PN的比较 正常内膜、在位内膜、异位内膜相比较，α-SMA阳性的周细胞依次递减，在正常内膜中α-SMA阳性细胞位于微血管的外周，符合周细胞的组织学分布，并可见α-SMA阳性细胞形成的条索状或管腔样微血管，而在异位内膜中α-SMA阳性细胞表达减少，呈散在、单一细胞分布，不形成微血管样结构，多数微血管上无或仅有1个α-SMA细胞分布，见图2。内膜PN定量结果显示：异位内膜低于正常增殖期内膜（P＜0.05），而与正常分泌期内膜相比差异无统计学意义；在位内膜无论增殖期还是分泌期与相应的正常内膜相比差异均无统计学意义；在位内膜增殖期高于分泌期，正常内膜增殖期高于分泌期（P＜0.05），见表1。

2.3 异位内膜、在位内膜、正常内膜PN/MVD的比较 异位内膜低于正常增殖期和正常分泌期内膜；在位内膜无论增殖期还是分泌期均低于相应的正常内膜；在位内膜增殖期高于分泌期，正常内膜增殖期高于分泌期(均P＜0.05)，见表1。

3 讨论

血管生成是指从已存在的血管生出新血管的过程，病理性血管生成主要发生于恶性肿瘤、缺血性、炎症性疾病中[4]。周细胞是除内皮细胞外血管的另一重要组分，周细胞在血管生成之前，其结构和功能即发生改变，参与诱导血管生成；在血管生成初期起着引导和支持作用[5]。除此之外，周细胞与内皮细胞之间通过多种信号途径相互作用共同调节血管形成、稳定、重塑等[1]。Betsholtz[2]通过针对转基因小鼠的研究证实，应用基因敲除的方法抑制周细胞的增殖、迁移、募集后，小鼠出现广泛的内皮细胞增殖、血管扩张、微血管瘤形成，于胚胎期死亡。还有研究发现：肿瘤血管幼稚化、不成熟、不稳定等特征以及肿瘤细胞的血管转移均与周细胞数量和周细胞/内皮细胞比值下降有关[3]。

EMs被认为是一种依赖于血管生成的疾病[6-7]，具有种植、侵袭、转移等肿瘤生物学行为，同时有研究指出EMs的发生及发展程度同病灶局部的炎症性反应密切相关[8]，然而大量关于周细胞及血管生成的研究多局限于肿瘤和炎症性疾病，周细胞在EMs血管生成中的研究却鲜有报道。本研究结果显示：无论EMs组在位内膜还是对照组正常内膜，分泌期内膜MVD均高于增殖期内膜，PN和PN/MVD则增殖期内膜高于分泌期内膜，表达随月经呈周期性改变，说明子宫内膜血管生成活跃时周细胞数量减少、周细胞覆盖下降，验证了周细胞对维持血管成熟、稳定的重要作用；异位内膜MVD明显高于对照组正常内膜，进一步证实了EMs是一种依赖于血管生成的疾病，丰富的血供是异位病灶的存活、生成的前提，也是EMs病灶发生出血、坏死等病变的基础。异位内膜的PN低于正常增殖期内膜，与正常分泌期内膜相比差异无统计学意义，而异位内膜的PN/MVD比值低于正常增殖期和分泌期内膜，说明同正常内膜相比，特别是同血管增殖相对活跃的分泌期内膜相比，异位内膜中周细胞的总数无明显差异，但是异位内膜血管中平均每个微血管上的周细胞数减少，即周细胞覆盖率降低，血管成熟度和稳定性较差，更易发生异常增殖和出血，正如临床所见EMs腹腔内病灶往往变现为表面血管丰富，多呈分支、网状、密集状态，常伴有出血和坏死。

近年来有报道指出，腹腔镜检查显示90%的女性经期都会发生经血逆流但是并非所有都发生EMs，故有学者提出了在位内膜决定论[9]。同非EMs患者相比，EMs患者的在位内膜黏附、侵袭、血管生成的能力均有明显差异[10-11]。本研究中EMs患者在位内膜同对照组正常内膜比较结果显示：2组之间同期别内膜的MVD、PN均无明显差异，但在位内膜无论增殖期还是分泌期，PN/MVD均低于相应的正常内膜，说明EMs患者的在位内膜同正常组相比虽然MVD和PN无明显不同，但周细胞覆盖率较低，血管周细胞与内皮细胞之间的连接减少，对内皮细胞的抑制作用减弱，血管稳定性较差，当发生经血逆流时更易在异地发生细胞迁移、增殖，诱导血管生成，这一结论同时也佐证了“在位内膜决定论”。综上，周细胞对EMs血管生成有重要作用，参与诱导血管生成启动、调节血管成熟、维持血管稳定，周细胞覆盖率是判定子宫内膜血管成熟度和稳定性的重要指标。提示以周细胞为靶点调节周细胞“正常化”有望成为抗EMs血管生成治疗的新途径。

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（2013-09-02收稿 2013-12-23修回）

（本文编辑 李国琪）

Roles of Pericyte in the Angiogenesis of Endometriosis

ZHAO Caiyun,YIN Lirong,SUN Junjie
Department of Gynaecology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective To study the expression of pericyte and the association between pericyte and angiogenesis in the endometriosis.Methodsthe endometriosis group is consisted of 20 ectopic endometrium,20 eutopic endometrium during proliferation phase,20 eutopic endometrium during secretory phase of patient with endometriosis.The control group (non-endometriosis)include 20 normal endometrium during proliferation phase and 20 normal endometrium during proliferation phase of women without entometriosis.The histological morphology parameters such as mean density of microvessel (MVD),pericytes number（PN）as well as the average ratio of pericyte to endothelial cells in microvessels were measured by immunohistochemical and morphological assesses.ResultsThe expression of MVD was lower in the normal endometrium and eutopic endometrium compared with it in ectopic endometrium tissue.The difference of the MVD among the different groups was statistical significant(P＜0.05).The expression of MVD in secretory phase endometrium was higher than it in proliferative phase endometrium(P＜0.05),and it shows no significant difference between eutopic endometrium and normal endometrium.The expression of PN and PN/MVD in ectopic and eutopic endometrium in EMs group were lower than those in control group.However,we also found that the difference of PN and PN/MVD was not statistically significant.ConclusionPericytes play an important role in angiogenesis of the endometriosis,and pericyte coverage contribute to maturing of functional vasculature of endometriosis.

endometriosis;neovascularization,physiologic;pericytes;immunohistochemistry;density of microvessel;angiogenesis

R711.71

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.008

天津医科大学第二医院妇科（邮编300211）

△通讯作者 E-mail:yinlirongfk@sina.com