补充天然虾青素对递增负荷训练大鼠骨骼肌自由基代谢的影响

沈 宁

（河海大学体育系，江苏 南京 210098）

补充天然虾青素对递增负荷训练大鼠骨骼肌自由基代谢的影响

沈 宁

（河海大学体育系，江苏 南京 210098）

目的：探讨补充天然虾青素和游泳训练对大鼠骨骼肌抗氧化能力的影响。方法：32只7周龄健康雄性SD大鼠适应性喂养3天后按体重随机分为4组。即对照组（C）、运动组（T）、服药组（M）和运动服药组（TM）。T组和TM组进行6周的递增负荷游泳运动，M组和TM组每天灌服天然虾青素，剂量为400mg/Kg BW。6周后，分别测定各组大鼠血液中肌酸激酶和乳酸脱氢酶含量，测定骨骼肌细胞中超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶含量。结果：长期递增负荷训练使大鼠血清LDH（P＜0.01）和CK（P＜0.01）水平显著上升，骨骼肌SOD活性、SOD/MDA比值、GSH-PX、T-AOC和CAT显著降低。补充天然虾青素显著降低了长期递增负荷训练大鼠血清的LDH、CK浓度和骨骼肌MDA的含量，同时显著提高骨骼肌SOD活性、SOD/MDA比值，GSH-PX、T-AOC和CAT活性。结论：①长期递增负荷训练使骨骼肌细胞膜结构和功能的完整性遭到了破坏，主要表现为血清LDH和CK浓度的增加。②补充天然虾青素显著降低了长期递增负荷训练大鼠血清的LDH、CK浓度和骨骼肌MDA的含量。骨骼肌SOD活性、SOD/MDA比值，GSH-PX、T-AOC和CAT显著增高，这可能是天然虾青素保护运动机体骨骼肌的细胞膜功能和结构完整性的机制。

天然虾青素；骨骼肌；自由基代谢；抗氧化能力

大量的实验研究证实天然虾青素因其独特的化学分子结构而具有超强的抗氧化性，且是一种非维生素A原的类胡萝卜素。天然虾青素对一些与生活方式有关的慢性病及神经退行性疾病等方面具有良好的治疗和预防作用。据大量文献报道，天然虾青素具有着色、抗氧化、保护肝脏、保护神经、控制炎症、增强机体免疫力、抗肿瘤作用、预防动脉粥样硬化和心肌梗死、抗缺氧、抗高血压、抗癌抑癌等多种生理功能，并且天然虾青素已被广泛地应用在化妆品和保健品上，在日常生活中已被人们肯定。然而，天然虾青素在运动领域的应用并不广泛，因此，本研究将初步探讨补充天然虾青素对大强度所运动诱导的自由基增多的影响，期望能为天然虾青素在运动医学领域中开发和应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物7周龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠32只，体重为160.05±3.45g，由徐州医学院动物实验中心提供。实验大鼠分笼饲养，常规饲料，自由饮食，自由饮水，饲料由徐州医学院动物实验中心提供。动物房自然采光，通风条件良好。温度维持在18℃-24℃，相对湿度为45％-55％。游泳训练水温为33±2℃，游泳池高110cm，直径80cm无毒塑料圆桶，水深大约为80cm。

1.2实验分组和运动方案实验大鼠购回适应性喂养三天后，按照实验设计的要求将实验动物随机分为：对照组（C组）、运动组（T组）、服药组（M组）和运动服药组（TM组）。

适应性游泳：在正式实验，T组和TMR组进行适应性游泳：第一天10min，第二天20min，第三天30 min，以此类推直达第6天60min。正式训练方案：T组和TM组大鼠，第一周不负重游泳40 min，以后每周递增10 min，到第四周游泳时间为60 min，负重1％，第五周负重2％，第六周负重3％，第四、五、六周时间均为60 min。每周训练六天，周日休息并称量大鼠体重。本实验的运动训练方式为游泳。参照乔玉成编著的《体育生物科学研究方法与技术》［1］中关于训练大鼠游泳运动“控制运动量的方法”和朱金等《大鼠游泳训练在运动实验中的应用方法》［2］，确定本实验的运动

时间和运动负重量。游泳训练时间安排在每天16：00至17：00。

1.3虾青素灌服方案本研究灌服虾青素的剂量为400mg/kg BW（根据天然虾青素官方网站专家的建议，此剂量相当于人体推荐量的20倍），因为大鼠对天然虾青素的吸收效果比较差。天然虾青素配合豆油溶剂，天然虾青素实际含量为20 mg/kg。服药组灌服虾青素，天然虾青素购于湖北荆州，对照组灌服豆油。

1.4动物取材和指标测试所有大鼠在末次实验结束后禁食12小时，禁食期间自由饮水。后各组大鼠根据体重采用腹腔注射20％氨基甲酸乙酯麻醉，剂量为5ml/Kg（约2m l/只），腹主动脉取血，并迅速将血液放入-20℃冰箱中保存以进行指标的测定。迅速取出骨骼肌放在冰冷的生理盐水中洗净血液，并用滤纸将其吸干，用铝箔纸包裹好装入密封袋中，迅速放入-80℃的冰箱中保存、待测。所有指标的测试均按试剂盒的操作说明严格执行。

1.4.1 组织匀浆的制备 从超低温冰箱中取出骨骼肌组织块，自然解冻，用滤纸拭干，称取0.4g骨骼肌组织放入小烧杯中。量取预冷的匀浆介质（0.86％的生理盐水），量取重量为骨骼肌重量9倍的生理盐水，制备浓度为10％骨骼肌匀浆。将制备好的组织匀浆用低温离心机3000r/min左右离心10-15min后吸取上清液，放入4℃冰箱中冷藏待测。

1.4.2 指标检测 酶标法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、TBA法检测丙二醛（MDA）含量、比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性、比色法检测总抗氧化能力（T-AOC）、比色法测定过氧化氢酶（CAT）活性，利用考马斯亮兰法进行蛋白定量。所有指标的检测方法都严格按照试剂盒说明书操作，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5 数据处理 本实验所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，对所有数据求平均值±标准差（±SD），并作单因素方差分析进行组间多重比较。以P＜0.05，具有显著性差异，以P＜0.01，具有极显著性差异。

2 结果

2.1大鼠体重变化从图1可以看出，各组大鼠的体重随时间的变化总体都呈上升的趋势。与C组相比，TM组大鼠体重（第五周末）显著低于C组（P＜0.05）；与C组相比较，M组大鼠体重（第六周末）显著低于C组（P＜0.05）；与C组相比，TM组大鼠体重显著低于C组，且具有显著性差异（P＜0.05）；与T组相比，TM组大鼠体重具有显著性差异（P＜0.05）。

图1 实验过程中各组大鼠体重变化趋势图

2.2各组大鼠血液中LDH和CK的变化从表2可以看出：与C组相比较，T组和TM组大鼠血清中LDH活性显著高于C组，其中T组具有极显著性差异（P＜0.01），TM组有显著性差异（P＜0.05）。与TR组相比较，M组和TM组血清中LDH活性显著低于T组（P＜0.01）。各组大鼠血清中CK指标的变化：与C组相比，T组和TM组都显著升高，T组具有极显著性差异（P＜0.01），TM组有显著性差异（P＜0.05）。与T组相比，M组和TM组血中LDH活性显著低于T组，均有非常显著性差异（P＜0.01）。见表1。

表1 大鼠血液中LDH和CK指标的比较

2.3骨骼肌细胞中SOD、MDA及SOD/MDA比值的变化SOD活性：与C组相比较，T组大鼠骨骼肌细胞中SOD活性显著下降（P＜0.05），M组SOD活性显著上升，TM组SOD活性有下降趋势，但没有统计学意义（P=0.053）。与T组相比，M组SOD活性显著高于T组（P＜0.01），TM组SOD活性显著高于T组（P＜0.05）。

表2 大鼠骨骼肌SOD、MDA及SOD/MDA比值指标的变化

MDA含量：与C组相比较，T组大鼠骨骼肌细胞中MDA的含量显著高于C组（P＜0.05），M组MDA含量显著低于C组（P＜0.01）。TM组MDA含量虽高于C组，但没有统计学意义（P＞0.05）。TM组骨骼肌细胞中MDA的含量显著低于T组，（P＜0.05）。

SOD/MDA比值：与C组相比较，T组显著低于C组（P＜0.01），M组显著高于C组（P＜0.01），TM组显著低于C组（P＜0.01）；与T组比较，M组常显著高于T组（P＜0.01），TM组高于T组（P＜0.01）。

2.4骨骼肌细胞中CAT、GSH-PX及T-AOC的变化由表3可知，CAT的比较：与C组相比较，T组CAT活性和C组具有显著性差异（P＜0.01），M组、TM组CAT活性与C组具有显著性差异（P＜0.05）；与T组相比较，M组和TM组CAT活性均显著高于T组（P＜0.01）。

表3 大鼠骨骼肌CAT、GSH-PX及T-AOC指标的比较

GSH-PX的比较：与C组相比，T组GSH-PX活性显著低于C组（P＜0.01），M组GSH-PX活性显著高于C组，TM组GSH-PX活性显著低于C组（P＜0.01）；与T组相比，M组活性显著高于T组（P＜0.01），TM组GSH-PX活性显著高于T组（P＜0.05）。

T-AOC的比较：与C组相比较，T组T-AOC活性显著性低于C组（P＜0.01），M组T-AOC活性显著高于C组（P＜0.01），TM组T-AOC活性显著低于C组；与T组相比较，M组活性显著高于T组（P＜0.01），TM组T-AOC活性显著高于T组。（P＜0.01）。此外TM组T-AOC活性虽显著低于C组，却显著高于TM组（P＜0.01）。

3 分析与讨论

3.1补充天然虾青素对长期递增负荷运动大鼠天然虾青素及游泳运动对大鼠体重的影响大量实验研究已证实，运动可以促进体内脂肪的消耗，使机体内储备的脂肪的含量减少，体重相对有下降的趋势。也有相关报导天然虾青素能减轻机体体重，引起机体的组成成分发生改变。Saravanan Bhuvaneswari等研究称，天然虾青素能限制大鼠体重的增加［3］。本实验研究发现；M组大鼠体重下降，这可能与虾青素能减轻机体体重，引起机体的组成成分发生改变有关。TM组大鼠体重下降的原因一方面与大鼠长期递增负荷训练使机体出现了负氮平衡有关，另一方面是与天然虾青素的补充产生了协同作用。

3.2补充天然虾青素对长期递增负荷运动大鼠血清LDH和CK水平的影响乳酸脱氢酶（LDH）是催化丙酮酸和乳酸之间相互转化的酶，广泛存在于各组织中，其中以骨骼肌、心肌、肝脏和肾脏中含量最丰富，血液中的LDH主要来源于骨骼肌，为肌型LDH（MLDH）。当组织细胞更新或被破坏时，LDH从细胞内溢出进入组织间液再进入血液，引起血液中LDH活性升高［4］，因此通过检测血液中的LDH活性的高低，可以反映组织细胞的损伤程度及对运动的适应能力。血液中LDH活性提高，提示组织细胞损伤严重或机体难以适应当前的运动强度。本实验研究发现：经过长期递增负荷运动后大鼠血清LDH含量显著升高，证实6周递增游泳运动增加了血液中LDH的含量。对长期递增负荷运动大鼠补充天然虾青素发现大鼠血清LDH浓度降低，提示服天然虾青素对细胞膜完整性产生一定的保护作用。

肌酸激酶（CK）广泛分布在人体心脏、骨骼肌、大脑和平滑肌中，其中含量最高的组织是与运动密切相关的骨骼肌。在正常情况下，肌细胞中CK的含量大大多于血液中的，极少透过肌细胞膜，然而在运动训练过程中，由于运动的刺激会产生自由基，自由基会攻击肌细胞膜上的不饱和脂肪酸，使细胞膜发生脂质过氧化反应，肌细胞膜发生损害，通透性增加，肌细胞膜中的CK就会透过细胞膜进入血液中，使血液中CK活性升高，因此，血液中的CK活性的高低反映了骨骼肌细胞损伤程度及对运动的适应程度，血液中CK活性可作为评定肌肉承受刺激和了解骨骼肌微细损伤及适应与修复的重要敏感的生化指标［5］。本实验研究证实：6周递增负荷游泳训练使了大鼠血清CK的含量增加。补充天然虾青素可以显著降低递增负荷游泳训练大鼠血清CK的含量，提示天然虾青素能清除运动导致的自由基产生，增强机体对自由基的清除能力，保护细胞膜免受损伤，降低脂质过氧化反应，保护细胞膜的完整性。

3.3天然虾青素协同递增负荷游泳运动对大鼠骨骼肌细胞中SOD和MDA及比值的影响超氧化物歧化酶（SOD）被誉为机体内抗自由基第一道防线，是机体内抗氧化酶系统中的重要组成部分，它的作用是歧化超氧阴离子（O2-·）生成H2O2和O2，从而阻断了毒性更强的羟自由基（OH·）的生成。研究证实，8周有氧跑台运动大鼠其脑中SOD的活性明显高于4周有氧跑台运动组和安静组，这说明了长期的有氧运动能增加大鼠脑中抗氧化系统酶的抗氧化能力，降低脂质过氧化水平［6］本实验研究发现，T组大鼠在长期递增负荷训练后SOD活性显著下降。本研究也发现，补充天然虾青素能显著抑制长期递增运动负荷所致的大鼠骨骼肌细胞SOD活性的降低。提示，虾青素加速了自由基的清除速率，从而大大降低机体脂质过氧化反应。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应所生成的各种脂质过氧化物中最重要的一种，MDA在机体中的含量变化直接反映机体内脂质过氧化的速率和强度［7］。本实验发现，6周递增负荷游泳训练降低了大鼠骨骼肌MDA的含量。补充虾青素协同递增负荷游泳训练使大鼠骨骼肌细胞（MDA）含量显著性下降。提示虾青素协同6周递增游泳运动能提高大鼠骨骼肌中抗氧化酶系的活性，提高了机体清除自由基的速率，提高机体抗氧化能力。

SOD是机体内清除自由基的主要抗氧化酶之一，测定其活性可以反映机体清除自由基的能力，而MDA是反映机体内自由基脂质过氧化反应的代表产物，其含量的多少可以反映机体内脂质过氧化的程度。SOD/MDA的比值可以更加全面的反映机体内抗氧化能力。本实验结果显示，补充虾青素协同递增负荷游泳训练大鼠骨骼肌细胞SOD/MDA比值显著上升，提示虾青素协同递增负荷游泳训练加速机体清除自由基的速率，提高了机体抗氧化的能力。

3.4补充天然虾青素协同递增负荷游泳运动对大鼠骨骼肌细胞GSH-PX、CAT及T-AOC的影响谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，主要存在于细胞质中，在线粒体及胞浆中所产生的H2O2常靠GSH-PX来清除。它还可以催化脂质氢过氧化（LOOH）或过氧化氢（H2O2）与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成氧化型谷胱甘肽（GSSH），起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。因此，测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）的活性可以衡量组织抗脂质过氧化的能力以及防止DNA、RNA的损伤。本实验结果显示：6周递增负荷游泳运动显著提高大鼠骨骼肌细胞GSH-PX含量，证明6周递增游泳运动训练能提高大鼠骨骼肌中GSH-PX的活性，提高机体抗氧化能力。补充天然虾青素协同递增负荷游泳运动能显著提高大鼠骨骼肌中GSH-PX的活性，提高机体的抗氧化能力，增加机体对运动产生的过氧化氢的清除，减少了过氧化氢对机体的损伤。

CAT广泛存在各种生物体内，清除H2O2是CAT的主要功能，它通过催化过氧化氢（H2O2）转变成为H2O和O2。上文已提及GSH-PX也能清除H2O2，但这两种酶清除的H2O2不是来自同一个部位。CAT主要集中在过氧化氢体（微体）中，组织内酶反应所产生的H2O2可被CAT清除，而线粒体中产生的H2O2则由GSH-PX来清除，未清除的H2O2可透过细胞膜进入胞浆中，在过氧化氢体中被CAT清除。本实验研究结果显示：T组大鼠骨骼肌细胞中CAT活性明显低于C组，提示6周递增负荷游泳运动可以显著降低大鼠骨骼肌细胞中CAT的活性，降低机体消除H2O2能力。补充天然虾青素可以有效提高递增负荷游泳运动大鼠骨骼肌细胞CAT的活性。提示补充虾青素可以显著提高运动大鼠骨骼肌细胞CAT的活性。

机体防御体系的总抗氧化能力（Total Anti oxide Capacity，T-AOC）的强弱与健康程度之间存在着密切的联系。机体内T-AOC水平越高，提示机体内利用非酶类抗氧化物质能力增强或抗氧化酶合成越多。反之，机体内抗氧化酶的合成越少或利用非酶类抗氧化物质能力减弱和（或）活性氧（ROS）生成过多，破坏了氧化-抗氧化的这一平衡状态。本实验研究结果显示，补充虾青素和6周递增负荷游泳运动均能提高大鼠骨骼肌细胞T-AOC活性。补充虾青素能显著提高6周递增负荷游泳运动大鼠骨骼肌细胞中总的抗氧化水平，提高酶促系统和非酶系统的防御能力，增强机体清除自由基的能力。

4 结论

（1）长期递增负荷训练使骨骼肌细胞膜结构和功能的完整性遭到了破坏，主要表现为血清LDH和CK浓度的增加。

（2）补充天然虾青素显著降低了长期递增负荷训练大鼠血清的LDH、CK浓度和骨骼肌MDA的含量，骨骼肌SOD活性、SOD/MDA比值，GSH-PX、T-AOC和CAT显著增高，这可能是天然虾青素保护运动机体骨骼肌的细胞膜功能和结构完整性的机制。

［1］乔玉成.体育生物科学研究方法与技术［M］.北京：中国科学文化出版社，2002.11：144.

［2］朱金，浦钧宗.大鼠游泳训练在运动实验中的应用方法［J］.中国运动医学杂志，1996，15（2）：125-129.

［3］Saravanan Bhuvaneswari，Elumalai Arunkumar，etal.Astaxanthin restricts weight gain，promotes insulin sensitivity and curtails fatty liver disease in mice fed a obesity-promoting diet［J］. Process Biochemistry，2010，（45）：1406-1414.

［4］彭莉，王启荣，毕秋芸.补充大豆多肽对递增负荷运动大鼠血清LDH、ALT、AST活性的影响［J］.北京体育大学学报，2008，2，31（2），199-201.

［5］苏全生，唐戎.递增负荷运动对人体血清一氧化氮、肌酸激酶等指标的影响［J］.中国临床康复，2003，6，12（7）：1848-1849.

［6］顾丽艳，赵娜娜，梁丹丹.运动对SD大鼠MDA、SOD、NGF含量的影响［J］.现代生物医学进展，2010，10，（7）：1277-1279.

［7］郭海英，许豪文.耐力训练对大鼠肝脏、股四头肌氧化系统降活性的影响［J］.中国应用生理学杂志，1999，15（1）：55-58.

Iinfluence of Natural Astaxanthin Supplementation on the Increasing Load Training Filtration Skeletal M uscle M etabolism of Free Radicals

SHEN Ning
（Hohai Universit，Nanjing Jiangsu 210098）

Purpose：The purpose of the research is to discuss the effect of gavaging astaxanthin combined with quantitative load swimming training on antioxidant capacity in rats′skeletalmuscle.Methods；32 healthymale SD rats of 7 weeks old are selected and fed adaptively for three days and divided into 4 groups randomly：control group（C），exercise group（T），medication group（M）and exercise medicine-taking group（TM）.The exercise group and exercise medicine-taking group undergo progressive load swimming exercise for 6 weeks，The treated group and the control group were gavaged natural astaxanthin daily，a dose of400mg/kg.Detection of ratblood Creatine kinase，lactate dehydrogenase content，skeletal muscle tissue superoxide dismutase，malondialdehyde，glutathione peroxidase，catalase content is conducted after 6 weeks swimming exercise.Results：long-term increasing load training significantly increases rats′serum LDH（P＜0.01）and CK（P＜0.01）levels，while skeletalmuscle SOD activity，SOD/MDA ratio，GSH-PX，T-AOC and CAT decrease significantly.Gavaging natural astaxanthin reduces serum LDH，CK concentration and skeletalmuscle MDA content induced by long-term increasing load training，but at the same time significantly increases the skeletalmuscle SOD activity，SOD/MDA ratio，GSH-PX，T-AOC and CAT.Conclusions：（1）long-term increasing load training damages the structure，function and integrity of the skeletalmuscle cellmembrane，which ismainly reflected in the increase of concentration of serum LDH and CK.（2）Gavaging natural astaxanthin reduces serum LDH，CK concentration and skeletalmuscle MDA content induced by long-term increasing load training. The SOD activity in skeletalmuscles，SOD/MDA ratio，GSH-PX，T-AOC and CAT increase significantly，which might be themechanism of natural astaxanthin to protect the function and structural integrity of the cellmembrane inmovement skeletalmuscles

natural astaxanthin；skeletalmuscle；free radicalmetabolism；antioxidant

G804.23

：A

：1001-9154（2014）02-0075-05

G804.23

A

1001-9154（2014）02-0075-05

江苏省教育厅自然科学基金项目（IK040192）。

沈宁（1977-）男，江苏徐州人，讲师，硕士，主要从事体育教育训练学研究。

2013-10-20