经皮三叉神经慢性电刺激对慢性癫痫大鼠海马和皮层内VGLUT1 表达的影响

贺慧艳，左 健，王倩倩，2，尹 娜，3，刘益民，王 玉

近年来，颅神经电刺激治疗癫痫和抑郁障碍等中枢神经系统疾病受到了很多学者的重视，其中三叉神经电刺激(trigeminal nerve stimulation，TNS)对癫痫的治疗作用已在癫痫患者和动物模型中得到证实［1，2］。本研究小组前期通过TNS 预处理大鼠，发现其癫痫发作程度明显低于对照组［3］，进一步验证了TNS 具有显著的抗癫痫作用，这为临床癫痫的治疗提供了一种新技术，但到目前为止尚无关于TNS抗癫痫作用机制的研究报道。兴奋性和抑制性神经传递的失衡是癫痫发作的核心机制［4］，兴奋性氨基酸谷氨酸经特异性囊泡型转运体转运到突触囊泡内，再经胞吐作用释放至突触间隙，进而引起突触后神经元发生相应的改变［5］。本实验中，我们用囊泡型谷氨酸转运体-1(vesicular glutamate transporter 1，VGLUT1)特异性标记谷氨酸能神经元突触囊泡［6］，通过腹腔注射匹罗卡品(Pilo)诱导慢性癫痫大鼠模型，并对其进行慢性周期性经皮三叉神经电刺激，观察经皮三叉神经慢性电刺激对慢性癫痫大鼠海马和皮层内VGLUT1 表达的影响，探讨TNS 干预慢性癫痫形成的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 选用成年健康雄性SD大鼠150 只，普通级，体重200±20 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，置于自由饮水进食、昼夜均衡、温度20 ℃～25 ℃、湿度50%的环境中，喂养1 w以适应环境。

1.2 癫痫模型的建立 随机选用100 只大鼠腹腔注射(ip)东莨菪碱(1 mg/kg)以拮抗匹罗卡品的外周胆碱能反应，30 min 后以匹罗卡品(360 mg/kg，美国Sigma 公司)腹腔注射诱导癫痫持续状态(SE)。大鼠行为学观察根据我们修改后的Racine5级评价标准［7］。Ⅰ级:出现面部抽搐，鼻毛抽动，前爪抓耳及咀嚼动作;Ⅱ级:出现点头运动，一侧前肢阵挛;Ⅲ级:出现肢体阵挛和轻微的身体抽搐;Ⅳ级:肢体阵挛，甩尾，牙关紧闭，全身抽搐;Ⅴ级:全身阵挛，失去平衡，跌倒并全身僵直。本研究以发作达到Ⅲ级或Ⅲ级以上痫性发作且持续时间超过30 min为诱导癫痫持续状态成功的标准，对于没有达到该标准的大鼠，每30 min 追加匹罗卡品(30 mg/kg)直至达到标准。SE 大鼠自出现Ⅲ级或Ⅲ级以上痫性发作1 h 后，给予地西泮(10mg/kg，ip)以终止发作，随后将SE 大鼠随机分为模型组(Pilo 组，n=50)和经皮三叉神经慢性电刺激组(TNS 组，n=50)，正常对照组(n=50)给予同剂量的生理盐水腹腔注射;各组又随机分为24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 5个亚组，每亚组10 只大鼠。

1.3 经皮三叉神经电刺激 参照我们以前的方法［3］对TNS 组大鼠进行经皮三叉神经电刺激(北京博洋生物器械有限公司KD-2A 型经皮电刺激仪)，简述如下:将经10%水合氯醛(0.3 ml/kg，ip)麻醉后的大鼠俯卧固定，把两个膜式电极对称放置于三叉神经分支-眶上神经分布区域，即眼眶上方约1 cm、中内1/3 交界处，外接经皮电刺激仪;设置刺激参数:频率140 HZ、电流10 mA、脉宽0.5 ms、正相脉冲，每次刺激30 s 后间歇5 min，每天连续刺激2 h，持续刺激一个月。正常对照组和Pilo 组大鼠的各刺激参数均设置为0，其余操作同TNS 组;各组操作均在固定时间段进行。

1.4 取材 实验动物分别在刺激结束后24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 行断头取脑，每组每个时点大鼠数量为10 只，其中5 只用于免疫荧光双标，另5 只用于Western blot 半定量分析。用于免疫荧光双标的大鼠取材:10%水合氯醛(0.35 ml/kg，ip)麻醉后固定大鼠，开胸经左心室行升主动脉插管，先以0.9%生理盐水100 ml 快速灌注以冲净脑内血液，接着用4%多聚甲醛100 ml 先快后慢灌注固定全身，直至出现全身僵硬、尾巴僵直。快速断头取脑并于4%多聚甲醛中固定过夜，PBS 清洗后在30%蔗糖中脱水至组织块沉底，以OCT 包埋后行冰冻切片，冠状面连续切片以观察海马和皮层，冰冻切片厚约10 μm。用于Western blot 的大鼠取材:大鼠经上述方法冲净脑内血液后，无需4%多聚甲醛灌注固定，快速断头取脑，迅速冰上分离皮层和海马，二者分别储存于相应冻存管中，－80 ℃冰箱保存以备Western blot 半定量分析。

1.5 免疫荧光双标观察皮层和海马内VGLUT1 的变化 将新鲜冰冻切片用4 ℃纯丙酮中固定、0.3%Triton X-100 通透、5%BSA 封闭后加一抗:豚鼠抗VGLUT1(1∶1000，Millipore)和兔抗MAP2(1∶200，Millipore)，室温下孵育1 h、4 ℃孵育过夜，PBS 漂后在避光条件下加入荧光标记二抗即山羊抗豚鼠TRITC(1∶500，ImmunoReagents)和驴抗兔DyLight488(1∶200，EarthOx)，37 ℃避光孵育1 h，然后PBS 漂洗、抗荧光淬灭封片液封片。阴性对照分别以PBS 代替相应一抗，其余操作同上。在荧光显微镜(Olympus IX71)下观察，采用同一曝光度分别对每张切片进行拍照，用Image Pro Plus6.0软件进行图像分析，分别计数海马和皮层平均每个神经元胞体阳性表达数、平均荧光强度。

1.6 Western blot 检测皮层和海马内VGLUT1的表达情况 以蛋白裂解液(含1 mmol PMSF)提取组织总蛋白，经BCA 法蛋白定量后加入2×SDS 上样缓冲液，沸水浴10 min 变性，样本(30 μg)经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经电转膜仪转印蛋白至PVDF 膜，用含5%(w/v)脱脂奶粉的洗脱缓冲液室温封闭1 h，加入一抗豚鼠抗VGLUT1(1∶5000)和小鼠抗β-actin(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液清洗后加入HRP 标记的二抗(1∶10000)，37 ℃孵育1 h;TBST 缓冲液清洗、ECL 化学发光，曝光后显影、定影。以β-actin 作为内参照物，扫描并用Quantity one 4.62 软件进行图像分析，测量相对光密度值(relative optical density，ROD)，计算相对表达量。

2 结果

2.1 海马内VGLUT1 的免疫荧光结果 正常对照组大鼠海马内VGLUT1 有广泛表达，齿状回门区和CA3区的表达量较多，锥体细胞层和齿状回的颗粒细胞层表达量较少。Pilo 组大鼠海马内，VGLUT1 表达量较正常对照组明显增多，平均荧光强度明显增强，尤以CA3区、齿状回门区和内分子层变化最为明显，锥体细胞层和齿状回的颗粒细胞层表达量也明显增多，呈先上升后下降的趋势，于72 h 左右达到高峰。以CA1区锥体细胞层VGLUT1的表达变化为例:Pilo 组与TNS 组较正常对照组在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 时VGLUT1 表达均明显增多。与Pilo 组相比，TNS 组平均每个神经元胞体VGLUT1 阳性表达数及平均荧光强度在24 h 明显增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。

2.2 皮层内VGLUT1 的免疫荧光结果 在正常对照组大鼠的皮层中VGLUT1 有基础表达，表达量较少，主要集中在神经元胞体和突起部位。Pilo组与TNS 组大鼠的皮层中VGLUT1 的表达较正常对照组明显增多，均呈上升的趋势，在72 h 左右达到高峰随后逐渐下降。与Pilo 组相比，TNS 组皮层内VGLUT1 的表达在24 h 明显增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 均明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。皮层内平均每个神经元胞体VGLUT1 阳性表达情况在相应时间点与上述结果并不完全一致，主要表现为在14 d 和28 d 时，TNS 组与Pilo 组相比差异仍有显著统计学意义(P＜0.01)，我们推断这可能是由分布在非胞体部位的VGLUT1 的表达发生了变化所致。

2.3 海马和皮层内VGLUT1 的半定量分析(Western blot)VGLUT1 在海马和皮层内的Western blot 分析结果与免疫荧光相似，Pilo 组与TNS 组大鼠海马和皮层内VGLUT1 的相对表达量在24 h、72 h、7 d、14 d、28 d 时均高于相应时间点正常对照组(P＜0.05，P＜0.01)。与Pilo 组相比，TNS 组VGLUT1 相对表达量在24 h 明显增多(P＜0.01)，在72 h、7 d、14 d、28 d 时明显减少(P＜0.05，P＜0.01)。海马内VGLUT1 的相对表达量在28 d 时、皮层内在14 d 和28 d 时均降至正常水平(P＞0.05)。

3 讨论

脑内兴奋-抑制平衡是保证脑稳态的重要条件，其复杂的调节机制是通过各种神经递质介导的，谷氨酸是哺乳动物脑内主要的兴奋性神经递质，它经VGLUT1 特异地转运入突触囊泡，再经胞吐作用释放至突触间隙，进而引起突触后神经元发生相应的改变［5，6］。VGLUT1 的表达水平通过影响谷氨酸能突触囊泡的量子大小而影响谷氨酸在生理或病理状态下的释放进而影响突触的可塑性［7，8］。Boulland JL 等人［9］发现在匹罗卡品诱导的癫痫大鼠模型的慢性期，海马CA1-CA3区VGLUT1 表达明显增多，且含VGLUT1 的突触终端也明显增多。与此一致，我们发现慢性癫痫大鼠模型的海马和皮层内VGLUT1 的表达均较正常对照组显著增加，我们推断慢性癫痫大鼠模型海马和皮层内谷氨酸能神经元兴奋性突触传递增强。

Navarro Mora G 等［10］发现，经匹罗卡品诱导的大鼠即使在急性期没有出现癫痫持续状态后期也可观察到癫痫自发性反复发作，这可能是匹罗卡品诱导一次癫痫发作后脑内发生一系列的可塑性改变而致脑兴奋性增高，最终发展成为具有自发性反复发作特点的慢性癫痫模型;在一次SE 后予以尽早的干预有可能改变这一发展过程从而起到减少癫痫发作的作用。三叉神经的多种刺激形式均可通过丘脑激活包括颞叶皮层、海马等感觉和运动皮层在内的广泛大脑区域［11～13］，有报道高频刺激视皮质和海马等处的神经元能够引起细胞兴奋性增加，兴奋性神经递质传递增强，使中间神经元活性代偿性增强，抑制性信号传导增强，进而使释放至突触间隙的抑制性神经递质增多;后者也可反作用于主体神经元，抑制其兴奋性，从而保持大脑自身的兴奋性和抑制性信号传导处于一种动态平衡状态，即大脑的自身稳态调节机制，而长期接受兴奋性刺激产生的大脑自身稳态调节的结果是神经元兴奋性降低的可塑性改变［14］。本文作者Wang 等人在培养的海马脑片上慢性阻断或减少兴奋性冲动传导，发现海马兴奋性的增高易于诱发痫性放电，且起抑制作用的中间神经元的存活和其内的GAD65/67 显著减少［15］。本实验中大鼠致SE 后予以经皮三叉神经电刺激处理一个月(这段时间正是慢性癫痫的形成过程)，我们发现TNS 刺激癫痫大鼠脑内VGLUT1 的表达较假刺激癫痫大鼠在TNS 终止后短时间内显著增多，而在其后的较长时间则显著减少，提示谷氨酸能神经元兴奋性突触传递先短时间内显著增强后较长时间显著减弱。我们推测经皮三叉神经慢性电刺激对癫痫形成过程中脑兴奋性易感性的形成有干预作用，长期慢性皮层和海马激活可能使皮层和海马产生一系列兴奋性适应性改变，从而提高了它们的兴奋性阈值，即降低了它们的兴奋性易感性。本研究小组在前期研究中发现经皮TNS 预处理的大鼠癫痫发作程度较对照组明显减轻，推测这与海马内GAD65/67 的表达量明显增多有关［3］。因此，我们推断经皮三叉神经慢性电刺激使脑的兴奋性易感性降低、内源性抑制机制增强，从而减少癫痫发作。此外，三叉神经传入纤维有部分终止于孤束核和蓝斑核［1］，蓝斑核在迷走神经电刺激抗癫痫的机制中起着非常重要的作用，刺激蓝斑核能明显减少惊厥发作［16］，而毁损蓝斑核则可促进慢性癫痫的形成或加重癫痫的自发性反复发作［17］，因此，三叉神经电刺激的抗癫痫作用是否与蓝斑核的信号传导有关有待进一步研究。

综上所述，在匹罗卡品诱导的慢性癫痫大鼠模型形成过程中，予以经皮三叉神经慢性电刺激处理降低了脑的兴奋性易感性，其机制可能与脑内VGLUT1 的表达先增多后减少有关;关于三叉神经慢性电刺激抗癫痫的确切机制仍待进一步研究。

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