β-甘露聚糖酶对豆粕、棉粕和菜粕的体外酶解效果研究

■田军辉 袁 林 乔家运 王志祥

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；2.天津市畜牧兽医研究所，天津300381）

β-甘露聚糖是非淀粉多糖（NSP）的一种，在植物性饲料原料中含量很高，如小麦、玉米、豆粕、菜粕以及麸皮中的β-甘露聚糖分别占非淀粉多糖含量的11.9%、11.7%、22.7%、19.6%和33.7%[1]。β-甘露聚糖被动物采食后，不易消化和吸收，具有较强的抗营养作用，对畜禽具有多种负面生理影响。目前认为降解β-甘露聚糖较为可行的方法是加入相应的酶制剂，能有效降低其抗营养作用。研究表明，日粮中添加β-甘露聚糖酶能促进动物生长[2]，提高饲料转化效率，提高养分消化率，改善肠道微生态，降低消化道食糜黏度，提高微量元素利用率等作用[3]。采用动物试验是评价β-甘露聚糖酶作用效果的主要方法，而有关其对豆粕、棉粕及菜粕的体外酶解效果研究尚不多见。因此，本文旨在通过体外消化试验来研究β-甘露聚糖酶对豆粕、棉粕和菜粕的酶解效果，为β-甘露聚糖酶合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用的豆粕、棉粕和菜粕分别由河南牧鹤饲料有限公司、郑州广安饲料科技有限公司和河南亿万中原生物技术有限公司提供。β-甘露聚糖酶由上海欧耐施生物技术有限公司提供，酶活≥50 000 U/g。酶活单位定义为：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3 mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1 μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。

胃蛋白酶液（3 mg/ml）：称取胃蛋白酶0.6 g，酶活800～2 500 U/g，加入200 ml生理盐水溶解。胰酶液（15 mg/ml）：称取胰酶3.0 g，1∶10 000，加入200 ml生理盐水溶解。磷酸缓冲溶液（pH值7.0）：分别称取NaH2PO4及Na2HPO448.69、174.80 g，加入4 000 ml蒸馏水水溶解。盐酸溶液（1∶3）：准确移取36%的盐酸10 ml，加入到30 ml蒸馏水中混匀。氢氧化钾溶液（7.5 mol/l）：称取KOH 420 g，定容到1 000 ml。阿洛酮糖（内标物），标准品（sigma公司生产，色谱纯）。

1.2 试验主要仪器及条件

气相色谱仪为岛津GC-2014C，毛细色谱柱为RTX-225。色谱条件：载气N2，压力为50 kPa；燃气H2，压力为40 kPa；助燃气高纯空气，压力为40 kPa。FID检测器温度280℃，气化室温度220℃，所有样品进样量均为2 μl，色谱柱流量为1.32 ml/min，分流比为18.0。

1.3 体外消化试验

分别以豆粕、棉粕、菜粕为底物，设Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5个组，β-甘露聚糖酶添加水平分别为0、0.4%、0.8%、1.6%和2.4%，每个水平设4个重复，模拟断奶仔猪消化道环境进行体外消化试验。用气相色谱仪测定酶解后可溶性单糖含量，筛选出β-甘露聚糖酶适宜添加水平。

将豆粕、棉粕、菜粕粉碎至40目筛，并混合均匀。称取2.5 g烘干至恒重的样品于三角烧杯中，根据试验设计加入不同水平的β-甘露聚糖酶，然后依次加入25 ml缓冲液、15 ml胃蛋白酶液，用1∶3 HCl将溶液pH值调至3.0。在温度（40±1）℃、振荡速率为50 r/min的恒温振荡器上消化4 h。取出冷却后，预调pH值至弱酸性，加入15 ml胰酶液，用7.5 mol/l的KOH溶液将pH值调至7.0。然后转入透析袋内，在上述相同条件下再消化4 h。消化结束后，用纱布过滤。

1.4 指标测定

上述滤液经处理后用气相色谱仪测定，根据气象色谱分析结果，用内标法计算出各单糖含量，参考刘强（1998）方法[4]，操作步骤根据具体情况稍作变动。

1.5 统计分析

试验数据用Excel2003初步整理。采用SPSS17.0分析软件统计分析，并进行Duncan's法多重比较，数据采用“平均值±标准差（X±SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 β-甘露聚糖酶对豆粕的酶解效果（见表1）

表1 β-甘露聚糖酶对豆粕的酶解效果（g/kg）

由表1可知，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组可溶性甘露糖含量分别比对照组（Ⅰ组）增加3.0%、3.9%、4.6%，差异显著（P＜0.05），Ⅴ组可溶性甘露糖含量比Ⅱ组增加3.2%，差异显著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三组之间，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三组之间以及Ⅱ与对照组之间差异均不显著（P＞0.05）。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组可溶性葡萄糖含量分别比对照组（Ⅰ组）增加4.3%、4.9%、6.1%，差异显著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三组之间以及Ⅱ组与对照组之间差异均不显著（P＞0.05）。考虑成本因素，确定β-甘露聚糖酶的添加量为0.8%。

2.2 β-甘露聚糖酶对棉粕的酶解效果（见表2）

表2 β-甘露聚糖酶对棉粕的酶解效果（g/kg）

由表2可知，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组可溶性甘露糖含量比对照组（Ⅰ组）分别增加7.4%、8.6%、8.9%，差异显著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三组之间以及Ⅱ组与对照组之间差异均不显著（P＞0.05）。Ⅳ、Ⅴ组可溶性葡萄糖含量比对照组（Ⅰ组）分别增加9.1%、10.5%，差异显著（P＜0.05），Ⅴ组可溶性葡萄糖含量比Ⅱ组增加6.3%，差异显著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三组之间，Ⅱ与Ⅲ组以及Ⅱ组与对照组之间差异均不显著（P＞0.05）。考虑成本因素，确定β-甘露聚糖酶的添加量为0.8%。

2.3 β-甘露聚糖酶对菜粕的酶解效果（见表3）

表3 β-甘露聚糖酶对菜粕的酶解效果（g/kg）

由表3可知，Ⅳ、Ⅴ组可溶性甘露糖含量比对照组（Ⅰ组）分别增加6.6%、9.5%，差异显著（P＜0.05），Ⅳ与Ⅴ组以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组之间差异均不显著（P＞0.05）。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组可溶性葡萄糖含量比对照组（Ⅰ组）分别增加12.2%、14.6%、16.7%，差异显著（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三组之间以及Ⅱ与对照组之间差异均不显著（P＞0.05）。考虑成本因素，确定β-甘露聚糖酶的添加量为1.6%。

3 讨论

近年来，在饲用酶制剂研究领域为了更简便、快捷的评估酶制剂的作用效果做了大量的研究。酶制剂评定方法主要有体外法和体内法。体外法是指通过模拟动物消化道环境对酶制剂作用效果进行评定的一种方法，此方法具有稳定性高、操作简便快捷、重现性好等优点[5]。目前，将体外法和体内法的结合应用是评估酶制剂作用效果研究热点。在研究酶制剂的作用效果时，首先通过体外消化试验对其作用效果进行综合评价和筛选，再用动物试验来验证，最终得到相应的试验结果[6]。

非淀粉多糖根据其水溶性可分为可溶性非淀粉多糖和不溶性非淀粉多糖[7]，可溶性非淀粉多糖的自身结构特点决定了其具有较强持水能力，溶解后产生黏性，这也正是可溶性非淀粉多糖产生抗营养作用的主要原因[8-9]。饼粕类原料中β-甘露聚糖被β-甘露聚糖酶降解产生的单糖、二糖、三糖、四糖等低聚糖，能够被动物吸收利用，给机体提供能量。因此，通过气相色谱仪检测可溶性甘露糖和葡萄糖的生成量，可直接反映β-甘露聚糖酶对豆粕、棉粕以及菜粕等的降解效果。

小肠的结构特点决定了其是营养物质吸收的主要场所，饲料碳水化合物在十二指肠由肠黏膜产生的二糖酶彻底分解成单糖（葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和核糖等）被吸收。日粮中添加β-甘露聚糖酶能水解β-甘露聚糖中的β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键，将其降解为甘露糖、葡萄糖等，促进机体消化和吸收，提高饲料利用率，改善生产性能。王洁等（2011）研究了棉粕非淀粉多糖的体外酶解效果，发现当甘露聚糖酶浓度为4 000 U/kg时，棉粕甘露糖和葡萄糖降解效果最明显，降解率分别为19.89%和13.74%，总可溶性非淀粉多糖降解率最大为10.38%[10]。本试验中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组豆粕可溶性甘露糖和葡萄糖含量比对照组显著增加（P＜0.05）；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组棉粕可溶性甘露糖含量比对照组显著增加（P＜0.05），可溶性葡萄糖含量Ⅳ、Ⅴ组比对照组显著增加（P＜0.05）；菜粕可溶性甘露糖含量Ⅳ、Ⅴ组比对照组显著增加（P＜0.05），可溶性葡萄糖含量Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比对照组显著增加(P＜0.05)。结果表明，随着β-甘露聚糖酶添加量的提高，可溶性甘露糖和葡萄糖含量逐渐增加，但β-甘露聚糖酶对两种糖产量的影响并不一致。一方面是因为不同底物β-甘露聚糖含量不同，导致酶解产生的甘露糖和葡萄糖量有一定的差异；另一方面尽管酶作用底物相同，但由于酶制剂本身的活性受很多因素影响，造成β-甘露聚糖酶对可溶性甘露糖和葡萄糖产量的影响不一致。

4 小结

以上试验结果表明，豆粕、棉粕及菜粕中分别添加0.8%、0.8%和1.6%的 β-甘露聚糖酶时，能够有效降解其中的可溶性β-甘露聚糖，显著增加可溶性甘露糖和葡萄糖的含量，提高饲料的利用率。