姜黄素改善慢性肺动脉高压肺血管重塑作用途径的研究*

李俊丽，范琰琰，叶光华，董缪武，林刻智，李 峰，喻林升

（温州医科大学基础医学院司法鉴定科学技术研究所，温州325035）

姜黄素是（curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，其色泽稳定且毒性很低，具有抗炎、抗氧化、抗诱变等广泛的药理作用［1］。慢性低氧性肺动脉高压的主要发病是低氧引起的肺血管重塑，形态显示肺动脉平滑肌细胞增生、血管胶原沉积、管壁增厚，因此，抑制肺动脉平滑肌细胞的增生作用，从而逆转肺血管重塑、减轻低氧性肺动脉高压成为重要的研究课题。本课题组及国内部分研究表明姜黄素可以抑制慢性低氧性细胞凋亡及减少肺血管细胞增生和管壁重塑［2］。

肺中含肥大细胞（mast cell，MC）丰富，是 MC的主要栖息地，其分为两类：一类是仅含类胰蛋白酶（tryptase）的TMC型，另一类是含类胰蛋白酶和类糜蛋白酶（chymase）的TCMC型，低氧刺激肥大细胞激活并脱颗粒，颗粒中含有大量细胞因子和酶类，其中类胰蛋白酶、类糜蛋白酶、MMPs、VEGF与低氧下肺血管增生和肺血管重塑有关［3］。近年来，炎症以及MC参与形成并维持肺动脉高压的机制研究得到广泛重视［4，5］，本课题组前期研究表明肺肥大细胞参与慢性低O2高CO2肺小动脉重塑的作用，但姜黄素能否通过MC途径调控慢性低O2高CO2性肺血管重塑的作用，国内外未见报道。本实验在以往的研究基础上进一步探究，姜黄素对慢性低O2高CO2性大鼠肺血管重塑的作用及影响，为临床防治慢性低O2高CO2性肺动脉高压提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD雄性大鼠由温州医科大学实验动物中心提供；兔抗大鼠TBS抗体及SABC试剂盒购自北京中杉金桥，姜黄素购自Sigma公司，其余试剂均为市售分析纯。

1.2 肺动脉高压模型的建立

常压低O2高CO2舱（长沙华曦电子科技有限公司，YCP系列）内 O2浓度维持8%～11%，CO2浓度维持3%～5%，温度20℃～25℃，湿度40%～70%（氧舱内多余水蒸汽用无水氯化钙吸收），每天8 h，每周6 d，连续4周，其余时间置于同一室内饲养。

1.3 分组与处理

从温州医科大学实验动物中心购得180～200 g SD雄性大鼠24只，普通清洁级动物实验室内适应性饲养三天，室内温度 20℃～25℃，湿度 40%～70%，随机分为四组（n＝6）：Ⅰ组（常氧空白对照组），Ⅱ组（低 O2高 CO2模型组），Ⅲ组（色甘酸钠对照组），Ⅳ组（姜黄素实验组）。Ⅰ组常氧下正常饲养四周，后3组动物放入常压低O2高CO2舱中，Ⅲ组同时给予色甘酸钠以20 mg／kg体重腹腔注射处理，IV组给予姜黄素混悬液按150 mg／kg体重灌胃处理。

1.4 肺小动脉显微结构观察

放血处死大鼠后，取肺叶组织，10%福尔马林溶液固定，脱水透明，浸蜡包埋，石蜡组织切片（4μm），HE染色后，光镜下观察肺细小血管显微结构并拍照。每张切片中选取5支直径100μm～200μm肺动脉，利用图像分析系统（IPP 6.0）测定肺细小动脉管壁／管总面积（vessel wall area／total area，WA／TA）、管腔／管总面积（vessel cavity area／total area，EA／TA）。

1.5 肺小动脉电镜观察超微结构

取肺门处肺动脉周围组织0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm组织块，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，乙醇、丙醇梯度脱水，EPON812包埋，固化，LKBV型超薄切片机切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，H-600型透射电镜下观察肺小动脉壁周围肥大细胞及其内皮细胞、内弹力板、平滑肌细胞、成纤维细胞、胶原增生情况，并拍照记录。

1.6 甲苯胺蓝染色肥大细胞测定

石蜡包埋组织切片（4μm）二甲苯脱蜡酒精梯度水化、甲苯胺蓝染色、脱水、中性树胶封固。光镜下观察，肺细小血管周围甲苯胺蓝染色阳性肥大细胞，每张切片随机选取5个含肺细小动脉高倍镜视野，计数个视野中肥大细胞细胞数（the number of mast cell，NMC），肥大细胞均数＝每组肥大细胞总数／所取视野数；肥大细胞脱颗粒率（degranulation rate，DR）＝脱颗粒肥大细胞数／肥大细胞总数。

1.7 类胰蛋白酶酶（TBS）的免疫组化检测

石蜡包埋组织切片，脱蜡、水化，常温下 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性10 min，微波热修复抗原活性，进口山羊血清封闭常温20 min，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素核复染，阳性细胞呈棕黄色。每张切片随机选取5个含肺细小动脉高倍镜视野，计数个视野中阳性细胞数。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠肺小动脉显微和超微结构观察

肺组织经HE染色光镜下观察，模型组相比正常组肺细小动脉管壁明显增厚，平滑肌细胞增生，内弹力板扭曲明显，管腔狭窄，同时模型组相比WA／TA明显增高（P＜0.05）、管腔／管总面积（EA／TA）明显降低（P＜0.05）；电镜下，正常组血管结构正常，平滑肌细胞及胶原未增生，内弹力板自然弯曲，内皮细胞扁平；模型组肺细小动脉中膜平滑肌增生，外膜胶原纤维密集，内弹力板扭曲，内皮细胞突起；提示慢性肺动脉高压模型建造成功。

光镜下，色甘酸钠组、姜黄素组相比模型组肺动脉管壁较薄，平滑肌细胞增生较少，内弹力板自然弯曲，管腔未见明显改变（图1），同时两组 WA／TA明显低于模型组（P＜0.05）、EA／TA明显高于模型组（P＜0.05），提示药物干预有效；两药物干预组相比正常组 WA／TA、EA／TA差异有统计学意义（P＜0.05），提示药物干预效果尚不完全；两药物 WA／TA、EA／TA差异不明显（P＞0.05），药效相近（表1）；电镜下，色甘酸钠组、姜黄素组血管结构基本正常，平滑肌增生及胶原增生较模型组轻。

Tab.1 Changes of WA／TA、EA／TA in four groups（%，，n＝24）

Tab.1 Changes of WA／TA、EA／TA in four groups（%，，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；WA／TA：Vessel wall area／total area；EA／TA：Vessel cavity area／total area*P＜0.05 vsⅠ group； ＃P＜0.05 vsⅡ group；TBS：Tryptase

Group WA／TA EA／TAⅠ37.98±2.31 62.02±2.31Ⅱ61.71±3.08* 38.29±3.08*Ⅲ51.51±2.48*＃ 48.49±2.48*＃Ⅳ48.56±2.77*＃ 51.44±2.77*＃

Fig.1 Morphological observation of pulmonary arteriole in rats（HE×200）

2.2 肥大细胞超微结构观察

电镜下，正常组肺小动脉周围肥大细胞胞膜完整；模型组肥大细胞内颗粒减少，胞膜不完整；色甘酸钠组、姜黄素组肥大细胞胞膜较完整（图2）。

Fig.2 Ultrastructural observation of pulmonary arteriole MC in rats（×10 000）

2.3 肥大细胞甲苯胺蓝染色

显微镜下观察可见正常组肺细小动脉周围肥大细胞内粗大颗粒染成紫红色，未脱颗粒细胞胞膜完整，胞浆染色加深，脱颗粒细胞形态不规整，胞浆淡染。模型组相比正常组肺细小动脉周围NMC明显增多（P＜0.05），DR增高（P＜0.05）；色甘酸钠组、姜黄素组相比模型组 NMC较少（P＜0.05），DR降低；色甘酸钠组的NMC、DR值相比姜黄素组未明显降低（P＞0.05），正常组的 NMC、DR值与两干预组相比差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

Tab.2 NMC、DRof Toluidine blue staining in four groups（，n＝24）

Tab.2 NMC、DRof Toluidine blue staining in four groups（，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；NMC：Number of mast cell；DR：Degranulation rate*P＜0.05 vsⅠ group；＃P＜0.05 vsⅡ group

Group NMC（cells／HPF） DR（%）3.05±0.62 18.33±10.40Ⅱ7.31±1.82* 56.02±2.39*ⅢⅠ4.18±1.55*＃ 20.17±10.88*＃Ⅳ4.46±1.30*＃ 22.34±13.42*＃

2.4 肥大细胞类胰蛋白酶（TBS）免疫组化检测

光镜下可见，正常组的肺细小动脉周围肥大细胞胞浆染成棕黄色，模型组相比正常组肺细小动脉周围肥大细胞细胞数即TBS阳性细胞明显增多（P＜0.05）；色甘酸钠组、姜黄素组相比模型组阳性细胞数明显减少（P＜0.05）；色甘酸钠组的阳性细胞数相比姜黄素组未明显降低（P＞0.05），正常组的阳性细胞数与两干预组相比差异无统计学意义（P＞0.05，表 3，图 3）。

Tab.3 Changes the number of mast cells with TBSin four groups（，n＝24）

Tab.3 Changes the number of mast cells with TBSin four groups（，n＝24）

Ⅰ：Normal group；Ⅱ：Hypoxia hypercapnia group；Ⅲ：Disodium cromoglycate group；Ⅳ：Curcumin group；TBS：Tryptase*P＜0.05 vsⅠ group；＃P＜0.05 vsⅡ group

Group TBS（cells／HPF）3.05±0.62Ⅱ7.31±1.82*Ⅲ4.18±1.55*＃ⅠⅣ4.46±1.30*＃

Fig.3 Immunohistochemical staining of TBSin mast cells in rats（IHC×200）

3 讨论

MC中类胰蛋白酶可通过多种特性促进血管重塑：具有促进纤维化的生物学功能，通过肺成纤维细胞表面的蛋白酶活化受体（proteinase-activated receptor，PAR）-2的激活诱导肺成纤维细胞增殖，肺动脉平滑肌细胞、内皮细胞增生，肺血管壁I型胶原的合成，最终导致肺血管壁的胶原纤维过量生成，胶原沉积［6，7］，从而导致肺动脉高压。此外，MC中类糜蛋白酶在低氧下由MC释放，可以促进局部血管紧张素Ⅱ的产生，而不依赖血管紧张素转换酶，从而提高血管紧张度。同时可激活内皮素和基质金属蛋白酶 13（MMPs-13）［8，9］，内皮素可以促进血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶原增殖，并参与介导炎症反应［10］。MMPs-13水平升高可促进血管胶原裂解，导致低分子量胶原片段沉积，这些片段又会刺激血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增生，从而加剧血管壁重塑［11］。

近年研究发现，姜黄素可以抑制慢性低O2高CO2性肺动脉平滑肌增生、减少肺血管壁胶原沉积、改善肺血管结构重塑。在本实验研究中，模型组相比正常组 WA／TA比值增大（P＜0.05）、EA／TA比值减小（P＜0.05），肺动脉平滑肌细胞增生，血管外膜胶原密集，肺血管明显重塑，提示慢性肺动脉高压模型建造成功。同时MC胞内颗粒减少，胞膜不完整。而姜黄素干预组相比模型组MC胞膜稳定，减少脱颗粒现象，WA／TA比值降低（P＜0.05）、EA／TA比值增大（P＜0.05），肺动脉平滑肌细胞不明显增生，内皮细胞、内弹力板等结构基本正常，血管外膜胶原未见明显沉积，肺血管重塑减轻。由此推测姜黄素可以通过稳定MC膜，抑制MC脱颗粒，从而防止颗粒中细胞因子和酶类参与慢性低氧下肺动脉高压肺血管重塑作用。

此外，Nishikawa等研究报道姜黄素可抑制血管周围等结缔组织型肥大细胞激活引起的慢性炎症反应，减轻结缔组织增生［12］。Baek等用 PAR-2和PAR-4受体激动剂在有姜黄素和无姜黄素的条件下培养人肥大细胞，结果姜黄素存在的条件下TNF-α和类胰蛋白酶分泌减少，发现姜黄素可以通过ERK通路抑制肥大细胞的激活，减少肥大细胞的脱颗粒［13］。这些发现证明姜黄素在机体内存在的情况下肥大细胞的增殖和激活作用可受到一定抑制。大量证据表明姜黄素可能是改善慢性低氧性肺动脉高压肺血管重塑颇具前景的药物，值得进一步研究。

然而姜黄素药理作用复杂，肥大细胞的生物学特性和作用机制也有待进一步的研究，动物模型与人之间也存在许多差异，有待进一步优化实验。因此，姜黄素作为临床药物预防和治疗慢性肺动脉高压还需要更深入的探索研究。

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