血管活性药物对冷暴露实验动物肢端皮肤温度的调节作用*

李 曦，安玉林，张 莉，肖忠海，刘嘉瀛，张 莹，王 军，杨丹凤，汪 海

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津300050）

血液循环为机体组织带来氧、营养物质以及热量，同时带走组织产生的代谢产物。机体肢端组织的氧、营养物质和热量供应主要由肢端微循环来保障，若微循环出现血流不畅，产生障碍，可导致组织血流供应不善，从而产生组织缺氧、温度下降等不良影响［1］。机体长时间暴露于寒冷环境中，由于热量大量散失、肢端血管收缩，造成微循环障碍、肢端温度下降，组织处于缺血缺氧状态，从而导致冷损伤［2］。扩张微血管、改善微循环可改善组织血流供应，增加组织维持正常生理功能所需的氧、营养物质及热量，有利于保持组织正常温度，有效降低冷损伤风险。

研究显示，由盐酸妥拉唑啉（tolazoline hydrochloride，Tol）和消旋山莨菪碱（racanisodamine，Ani）等药物组成的方剂能提高寒冷环境中人体肢端皮肤温度［3，4］，具有预防冷损伤的潜在效果，其中主要成分Tol是短效非选择性α受体拮抗剂，能舒张血管，但同时也具有兴奋心脏［5］和胃肠道平滑肌［6］等作用；Ani是常用的M受体拮抗剂，可松弛平滑肌，解除血管痉挛，改善微循环障碍，同时扩瞳、中枢兴奋等副作用较小，临床也曾用于冻疮的治疗［7］。

本研究使用α1受体拮抗剂盐酸哌唑嗪（prazosin hydrochloride，Pra）替换 Tol，Pra可选择性地拮抗α1肾上腺素受体，具有比Tol更强的扩张外周血管、降低外周阻力的作用，同时可有效减少Tol产生的加快心率和兴奋胃肠道平滑肌的副作用，与Ani联用能有效舒张微血管［8］，改善微循环。本研究设想将选择性α1受体拮抗剂和M受体拮抗剂联用，通过舒张微血管，解除微循环障碍，改善肢末端组织供血供氧，减少或减缓冷暴露环境下动物肢端温度的下降，保护肢端组织。因此，本研究通过建立大鼠、小鼠冷暴露实验模型，评价两药物联用提高肢端温度的效果，为冷损伤预防药物研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级健康雄性Wistar大鼠（160～180 g，卫生学环境医学研究所动物中心）、清洁级健康雄性KM小鼠（18～20 g，卫生学环境医学研究所动物中心）、盐酸哌唑嗪（山东信谊制药有限公司）、消旋山莨菪碱（河南普瑞制药有限公司）、盐酸妥拉唑啉（湖北康宝泰精细化工有限公司）。

1.2 主要仪器

红外摄像仪（T335，美国FLIR公司）、人体温度测定仪（92000-05，新加坡Eutech公司）、低温人工气候舱（控温范围：-40℃～20℃，精确度 0.1℃，温度波动范围1℃）。

1.3 实验分组

将80只实验动物称重后按质量排序，再使用SPSS软件生成一组1～动物数量之间的随机数字，依次赋予各实验动物，再按随机数字大小排序，将实验动物依次分入各实验组中（尾温测定为80只，肛温测定为50只）。

1.4 冷暴露实验模型

室温下先使用红外摄像仪对实验动物尾部拍摄3次，测定尾部近心端1／3处的皮肤温度，其平均值记为T0，再分别灌胃给予空白（蒸馏水）和各剂量受试药物，给药后60 min将实验动物放入低温舱，于指定温度冷暴露，并于给药后180 min和300 min使用红外摄像仪进行拍摄，测定尾部近心端1／3处的皮肤温度，分别记为T180和T300，用T180和T300减去T0得到ΔT180和ΔT300。

1.5 血管活性药物对大鼠肢端皮肤温度的影响

共设计了3个实验，分别评价单独使用Pra和Ani以及两药联用的效果。

Pra药效：共分为 8组（n＝10）：依次为 1（空白组）、2（0.20 mg／kg）、3（0.40 mg／kg）、4（0.80 mg／kg）、5（1.60 mg／kg）、6（3.20 mg／kg）、7（6.40 mg／kg）、8（对照组，Ani 1.80 mg／kg＋Tol 8.80 mg／kg），室温 21℃～25℃，冷暴露温度5℃。

Ani药效：共分为 8组（n＝10）：依次为 1（空白组）、2（0.35 mg／kg）、3（0.70 mg／kg）、4（1.40 mg／kg）、5（2.80 mg／kg）、6（5.60 mg／kg）、7（11.20 mg／kg）、8（对照组，Ani 1.80 mg／kg＋ Tol 8.80 mg／kg），室温21℃～25℃，冷暴露温度5℃。

两药联用药效：共分为8组（n＝10）：依次为1（空白组）、2（Pra 0.20 mg／kg＋ Ani 1.40 mg／kg）、3（Pra 0.40 mg／kg＋Ani1.40 mg／kg）、4（Pra 0.80 mg／kg＋Ani1.40 mg／kg）、5（Pra1.60 mg／kg＋Ani1.40 mg／kg）、6（Pra 3.20 mg／kg＋Ani 1.40 mg／kg）、7（Pra 6.40 mg／kg＋Ani 1.40 mg／kg）、8（对照组，Tol 8.80 mg／kg＋Ani1.80 mg／kg），室温 21℃～25℃，冷暴露温度5℃。

1.6 血管活性药物对小鼠肢端皮肤温度的影响

共设计了3个实验，分别评价单独使用Pra和Ani以及两药联用的效果。大鼠、小鼠间等效剂量按体表面积比计算，小鼠实验所用药物剂量均为与大鼠实验相应的等效剂量。

Pra药效：共分为 8组（n＝10）：依次为 1（空白组）、2（0.30 mg／kg）、3（0.60 mg／kg）、4（1.20 mg／kg）、5（2.40 mg／kg）、6（4.80 mg／kg）、7（9.60 mg／kg）、8（对照组，Tol 12.50 mg／kg＋ Ani 2.50 mg／kg），室温21℃～25℃，冷暴露温度18℃。

Ani药效：共分为 8组（n＝10）：依次为 1（空白组）、2（0.50 mg／kg）、3（1.00 mg／kg）、4（2.00 mg／kg）、5（4.00 mg／kg）、6（8.00 mg／kg）、7（16.00 mg／kg）、8（对照组，Tol 12.50 mg／kg＋Ani 2.50 mg／kg），室温21℃～25℃，冷暴露温度18℃。

两药联用药效：共分为8组（n＝10）：依次为1（空白组）、2（Pra 0.30 mg／kg＋ Ani 2.00 mg／kg）、3（Pra 0.60 mg／kg＋Ani 2.00 mg／kg）、4（Pra 1.20 mg／kg＋Ani2.00 mg／kg）、5（Pra 2.40 mg／kg＋Ani2.00 mg／kg）、6（Pra 4.80 mg／kg＋Ani 2.00 mg／kg）、7（Pra 9.60 mg／kg＋Ani2.00 mg／kg）、8（对照组，Tol 12.50 mg／kg＋Ani2.50 mg／kg），室温 21℃～25℃，冷暴露温度18℃。

1.7 血管活性药物对小鼠肛温的影响

将50只小鼠随机分为 5组（n＝10）：1（空白组）、2（Pra 0.20 mg／kg＋ Ani 0.67 mg／kg）、3（Pra 0.60 mg／kg＋Ani2.00 mg／kg）、4（Pra 1.80 mg／kg＋Ani 6.00 mg／kg）、5（对照组，Tol 12.50 mg／kg＋Ani 2.50 mg／kg），室温 21℃～25℃，冷暴露温度 18℃。

室温下测量小鼠肛温后灌胃给予各组受试药物，给药60 min后将小鼠放入18℃的低温舱中，300 min后再次测定肛温。

1.8 数据统计

2 结果

2.1 血管活性药物对冷暴露大鼠肢端皮肤温度的影响

单独使用Pra和Ani药效评价结果显示各时间点实验组尾温之间无统计学差异（数据未列出），说明在本实验条件下药物对冷暴露大鼠尾温没有影响。

两药联用药效评价实验结果见表1，室温下大鼠平均尾温约32.0℃～33.0℃，T0各组数据间无显著差异；5℃冷暴露120 min后，尾温发生显著下降，达到约10.0℃，T180第7组显著高于空白组和对照组；ΔT180第7组显著高于空白组，对照组显著高于除第7组之外的各组，说明高剂量（Pra 6.40 mg／kg＋Ani 1.40 mg／kg）组方药在 180 min时有效，对照组效果与第7组相当并优于其余剂量组；冷暴露240 min后，尾温较冷暴露120 min时略有回升，T300第3、5、6、7组显著高于空白组，对照组也高于空白组；ΔT300第3、5、6、7组和对照组显著高于空白组，其中第6、7组较空白组高4.3℃，说明此时组方药在低剂量（Pra 0.40 mg／kg＋Ani 1.40 mg／kg）下就能发挥药效，且具有剂量依赖性，对照组也有效，其效果与其余有效的给药组相当。

Tab.1 Tail skin temperatures of two drugs combination in rats（℃，，n＝10）

Tab.1 Tail skin temperatures of two drugs combination in rats（℃，，n＝10）

Pra：Prazosin hydrochloride；Ani：Racanisodamine；Tol：Tolazoline hydrochloride；T0，T180 and T300：Tail skin temperatures at 0，180 and 300 min；△T180＝T180-T0；△T300＝T300-T0*P＜0.05，**P＜0.01 vs T0；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control

Group Dose（mg／kg） T0 T180 ΔT180 T300 ΔT300 1 Control 33.0±1.6 10.7±0.9 -22.4±2.1 11.7±1.3 -21.4±2.4 2 0.20 Pra＋1.40 Ani 32.7±1.6 10.3±0.7 -22.4±1.5＃ 12.3±1.9 -20.4±2.1 3 0.40 Pra＋1.40 Ani 32.9±1.7 10.1±0.5 -22.8±1.7＃＃ 14.5±2.2** -18.4±1.7**4 0.80 Pra＋1.40 Ani 32.6±1.1 10.3±0.9 -22.3±1.5＃＃ 12.7±1.3 -20.0±2.0 5 1.60 Pra＋1.40 Ani 32.4±0.9 9.8±0.6*＃＃ -22.6±1.3＃＃ 13.5±1.2** -18.8±1.8*6 3.20 Pra＋1.40 Ani 32.8±1.2 11.1±1.9 -21.8±2.1＃ 15.7±3.1** -17.1±3.0**7 6.40 Pra＋1.40 Ani 32.5±0.8 12.5±1.7*＃ -20.0±1.9* 15.4±4.0** -17.1±3.9**8 8.80 Tol＋1.80 Ani 32.1±1.6 12.5±4.4 -19.6±3.8** 13.6±2.2* -18.5±2.1*

2.2 血管活性药物对冷暴露小鼠肢端皮肤温度的影响

Pra药效评价实验结果见表2，室温下小鼠平均尾温约 30.0℃ ～31.0℃，T0各组数据间无显著差异；18℃冷暴露120 min后，尾温发生显著下降，达到约21.0℃，T180第 2、3、6组显著高于空白组和对照组；ΔT180第2、6组显著高于空白组和对照组，说明Pra在低剂量（0.30 mg／kg）和高剂量（4.80 mg／kg）下有效，高剂量组优于低剂量组，对照组无效；冷暴露240 min后，尾温较冷暴露120 min时基本相当，T300第6、7组显著高于空白组，第6组显著高于对照组；ΔT300第6、7组显著高于空白组和对照组，最多较空白组高4.9℃，对照组仍然无效。

Tab.2 Tail skin temperatures of Pra administration in mice（℃，，n＝10）

Tab.2 Tail skin temperatures of Pra administration in mice（℃，，n＝10）

Pra：Prazosin hydrochloride；Ani：Racanisodamine；Tol：Tolazoline hydrochloride；T0，T180 and T300：Tail skin temperatures at 0，180 and 300 min；△T180＝T180-T0；△T300＝T300-T0*P＜0.05，**P＜0.01 vs T0；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control

?

Ani药效评价实验结果显示各时间点实验组尾温之间无统计学差异（数据未列出），说明在本实验条件下Ani对冷暴露小鼠尾温没有影响。

两药联用药效评价实验结果见表3，室温下小鼠平均尾温约30.0℃～31.0℃，T0各组数据间无显著差异；18℃冷暴露120 min后，尾温发生显著下降，各组降幅差异明显，T180第 4、5、6、7组均显著高于空白组，对照组显著高于空白组和第3组；ΔT180第5、7组显著高于空白组，最多达4.3℃，第7组显著高于对照组，说明组方药此时在较高剂量（Pra 2.40 mg／kg＋Ani 2.00 mg／kg）下才产生药效，而对照组无效；冷暴露240 min后，尾温较冷暴露120 min时略有下降，T300第 7组显著高于空白组；ΔT300第 6、7组显著高于空白组，最多达4.4℃，说明组方药在高剂量（Pra 4.80 mg／kg＋ Ani 2.00 mg／kg）下能发挥药效，对照组此时有效。

Tab.3 Tail skin temperatures of two drugs combination in mice（℃，，n＝10）

Tab.3 Tail skin temperatures of two drugs combination in mice（℃，，n＝10）

Pra：Prazosin hydrochloride；Ani：Racanisodamine；Tol：Tolazoline hydrochloride；T0，T180 and T300：Tail skin temperatures at 0，180 and 300 min；△T180＝T180-T0；△T300＝T300-T0*P＜0.05，**P＜0.01 vs T0；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control

Group Dose（mg／kg） T0 T180 ΔT180 T300 ΔT300 1 Control 29.9±2.3 21.2±1.2 -8.2±2.8 19.6±0.9 -9.8±2.1 2 0.30 Pra＋2.00 Ani 30.4±1.8 22.4±3.4 -7.7±3.5 18.9±0.8 -11.2±2.2＃＃3 0.60 Pra＋2.00 Ani 30.0±1.5 21.3±0.9＃ -8.6±1.7 19.2±1.8 -10.7±2.5＃＃4 1.20 Pra＋2.00 Ani 30.6±2.0 24.4±2.7** -6.2±2.6 19.2±1.6 -11.4±2.9＃＃5 2.40 Pra＋2.00 Ani 31.1±1.5 26.1±3.2** -5.0±3.7* 22.6±3.1 -8.5±3.5 6 4.80 Pra＋2.00 Ani 30.3±1.5 24.2±2.8** -6.1±3.0 23.5±3.9 -6.8±4.4*7 9.60 Pra＋2.00 Ani 29.2±1.1 25.4±3.3** -3.9±3.4**＃ 23.8±2.0** -5.4±2.2**8 12.50 Tol＋2.50 Ani 30.2±1.9 23.4±2.8* -6.8±3.6 23.7±3.4 -6.4±3.3**

以T300的各组数据进行logistic拟合，可得到组方药物在给药后300 min时的量效关系曲线（图1，剂量以 Pra计，Ani剂量均为 2.00 mg／kg），EC50＝1.97 mg／kg，Emax＝4.8℃。

Fig.1 Dose-effect relationship of two drugs combination at 300 min in mice

2.3 血管活性药物对冷暴露小鼠肛温的影响

小鼠肛温测定结果见表4，T0的2、3、4组显著低于空白组和对照组，T300结果与 T0一致，ΔT各组间无统计学差异，说明各组小鼠在实验前后肛温的改变是一致的。

3 讨论

当机体受到寒冷刺激，会产生两种主要生理反应：（1）减少散热。肾上腺素、去甲肾上腺素和皮质醇等激素分泌增加，引起外周血管收缩，全身血液分布发生向心性改变，从而减少体表热量散失，以保持体心温度的恒定［9］。（2）增加产热。机体代谢率提高，糖原、脂肪动员，导致血糖、游离脂肪酸等能源物质浓度上升；同时产生寒战，释放大量热量。这两种生理过程都是机体为保持核心体温产生的保护性反应，避免产生低体温而发生生命危险。然而，外周血管收缩可导致肢端组织血液供应减少，氧、营养物质以及热量供应不足，导致皮肤温度下降，产生局部冷损伤风险［10］。因此，在保证机体能量供应和体温恒定的前提下，通过药物舒张外周微循环，改善冷暴露环境下肢端组织血流和热量供应，保持或提高肢端温度，延缓或避免冷损伤的发生，延长寒冷环境中的安全活动时间，为寒冷环境下野外活动提供安全保障，同时也能为自然灾害、突发事故等情况下的冷损伤救治赢得宝贵的时机，减小损失。

Tab.4 Rectal temperatures of two drugs combination in mice（℃，，n＝10）

Tab.4 Rectal temperatures of two drugs combination in mice（℃，，n＝10）

Pra：Prazosin hydrochloride；Ani：Racanisodamine；Tol：Tolazoline hydrochloride；T0 and T300：Rectal temperatures at 0 and 300 min；△T＝T300-T0*P＜0.05，**P＜0.01 vs T0； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control

Group Dose（mg／kg） T0 T300 ΔT 1 Control 37.0±0.6 37.8±0.6 0.8±0.6 2 0.20Pra＋0.67Ani 36.2±0.7*＃＃ 36.6±1.2**＃＃ 0.4±1.4 3 0.60Pra＋2.00Ani 36.1±0.6**＃＃ 36.6±0.5**＃＃ 0.4±0.6 4 1.80Pra＋6.00Ani 36.3±0.7*＃＃ 36.8±0.6**＃＃ 0.6±0.6 5 12.50Tol＋2.50Ani 37.1±0.6 37.8±0.5 0.7±0.7

本研究前期已在体外血管环模型上筛选和评价了不同药物组合对肢端微血管的舒张作用，发现Pra和Ani联用舒张肢端微血管效果较好［8］。因此，本文从改善肢端微循环所产生的效果——肢端温度提高来评价两种药物的药效。Ani能解除微血管痉挛，但是血管扩张作用并不强，而且口服吸收较差，个体差异明显，临床常注射给药。单独使用Ani不能提高大鼠、小鼠的肢端皮肤温度，说明其并未直接增加微循环血流量。Pra是选择性突触后α1受体拮抗剂，能同时扩张阻力血管和容量血管，对肢端微血管有直接的舒张作用，但是单独使用Pra增加微循环血流量和提高肢端皮肤温度的效果并不理想，只有在高剂量下小鼠冷暴露模型上观察到药效。而两药联用后，既可舒张微血管，又能解除微血管痉挛，改善冷暴露引起的微循环障碍，起到了提高肢端皮肤温度的作用，在给药后5 h仍然有效。原45号方小鼠给药剂量为 Tol 12.50 mg／kg、Ani 2.50 mg／kg，且动物实验并未观察到药效，使用Pra等摩尔替换原 45号方中的 Tol，应给药 27.10 mg／kg，而本实验小鼠尾温结果显示 Pra 1.20 mg／kg与 Ani 2.00 mg／kg就能显示出明显药效，说明使用Pra替换Tol药效更优。

肛温反映了动物的体温，如果肛温下降，则说明使用药物产生了热债，不能维持核心温度，有产生低体温的风险。本研究选择了本课题组前期在小鼠鼠尾血栓形成实验中筛选的最优比例Pra 0.60 mg／kg与Ani 2.00 mg／kg作为中间剂量，等比增加和缩小3倍为高、低剂量来进行小鼠肛温的研究。结果表明，小鼠冷暴露后肛温并未出现下降，说明药物在扩张微血管、提高肢端皮肤温度的同时仍能保持体温，满足安全的前提。而包括空白组在内的各组体温均有少量上升，这可能是由于代谢率提高，机体产热增加导致，而各组体温差值间无差异说明药物未对体温造成不良影响。

综上所述，α1受体拮抗剂Pra和M受体拮抗剂Ani联用能增强改善微循环的效果，有效提高冷暴露环境下大鼠、小鼠的肢端皮肤温度，可降低冷损伤的风险，同时不会产生热债，降低体温，具有预防冷损伤的药用价值。其效果优于阳性对照药。

感谢军事医学科学院研究生部统计学教研室柳伟伟老师对本研究数据分析和统计提供的支持与帮助。

［1］ Kelechi TJ，Michel Y.A descriptive study of skin temperature，tissue perfusion，and tissue oxygen in patients with chronic venous disease［J］.Biol Res Nurs，2007，9（1）：70-80.

［2］ Makinen TM，Hassi J.Health problems in cold work［J］.Ind Health，2009，47（3）：207-220.

［3］ 张是敬，赵松山，姚家邦，等.口服辅助防冻药45号方的试验研究［J］.军队卫生杂志，1985，1：8-12.

［4］ 张是敬.口服冻伤预防药25号及38号方的效用［J］.中国人民解放军军事医学科学院院刊，1979，3：371-374.

［5］ Paret G，Eyal O，Mayan H，et al.Endotracheal tolazoline：pharmacokinetics and pharmacodynamics in dogs［J］.Acta Paediatr，1999，88（9）：1020-1023.

［6］ Read MR，Duke T，Toews AR.Suspected tolazoline toxicosis in a llama［J］.J Am Vet Med Assoc，2000，216（2）：227-229.

［7］ 卢文兴.山莨菪碱治疗冻疮50例［J］.皮肤病与性病，2007，4：34-35.

［8］ 宁 萌，黄景慧，张雁芳，等.改善血栓形成新的药物组合物及其分子机制［J］.中国应用生理学杂志，2014，30（2）：184-188.

［9］ Turk EE.Hypothermia［J］.Forensic Sci Med Pathol，2010，6（2）：106-115.

［10］ Lehmuskallio E，Hassi J，Kettunen P.The skin in the cold［J］.Int J Circumpolar Health，2002，61（3）：277-286.