吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室重构的影响*

李先伟，汪向明，李 曙，杨解人△

（1.皖南医学院药理学教研室，2.皖南医学院附属弋矶山医院病理科，3.皖南医学院病理生理学教研室，安徽芜湖241002）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是以肺动脉压力增高为特征的一类疾病，主要病理变化为肺动脉血管管腔狭窄、闭塞，引起肺动脉压力升高、阻力增加，近而加重右心室后负荷，严重时导致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡，故防治肺动脉高压和右心室重构具有重要的意义［1，2］。研究表明氧化应激在肺动脉高压右心重构中发挥了重要的作用［3］。NADPH氧化酶 4（NADPH oxidase 4，NOX4）诱导产生的活性氧自由基（reactive oxygen specie，ROS）可促进肺动脉血管外膜成纤维细胞增殖并抑制其凋亡，在PH右心室重构发生过程中起着重要作用［4］。

吴茱萸次碱（rutaecarpine，Rut）是从吴茱萸中提取的一种吲哚喹唑啉类生物碱，具有舒张血管降低血压、抑制血管平滑肌细胞增殖、保护心肌缺血再灌注损伤、减轻减轻异丙肾上腺素诱导的心肌重构等作用［5-7］。最新的研究表明，Rut能够减轻缺氧-复氧诱导的心肌细胞损失及凋亡，其机制与其抗氧化，抑制NADPH氧化酶的表达有关［8］。基于以上的研究背景，本研究以肺动脉高压右心室重构为模型，选择NOX4为靶点，探讨Rut对肺动脉高压大鼠右心室重构的保护作用及机制，为防治心肌重构提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

野百合碱（Monocrotaline，MCT）（美国 Sigma）。吴茱萸次碱（≥98%，分子式：C18H13N3O，上海纯优生物科技有限公司）。Masson染色试剂盒（南京凯基）。总抗氧化能力（total antioxidative capacity，TAOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及BCA蛋白检测试剂盒均购于江苏碧云天生物技术研究所。TRI-zol RNA提取试剂盒购自美国 Invitrogen公司。PrimeScriptTM RT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix（大连宝生物工程有限公司），引物设计合成（上海生工）。小鼠抗大鼠GAPDH、NOX4单克隆抗体（美国Santa Cruz），小鼠抗大鼠collagen I及 collagen III单克隆抗体（美国 Abcam），LunimataTM Crescendo发光液（美国 Millipore）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的制备 雄性SD大鼠48只，体重180～220 g（南京市江宁区青龙山动物试验中心），许可证号：SCXK（军）2007-012。大鼠适应性喂养一周，按体重随机分为：正常对照组（Control）；野百合碱（MCT）组；MCT＋ Rut（20 mg／kg）剂量组；MCT＋ Rut（40 mg／kg）剂量组（n＝12）。MCT（60 mg／kg）单次皮下注射复制肺动脉高压动物模型。Rut用羧甲基纤维素钠充分混匀，于次日上午8∶00-10∶00开始灌胃给药，每天一次连续给药4周。所有大鼠实验期间自由进食、饮水。

1.2.2 血流动力学指标的测定 给药4周后，大鼠用戊巴比妥钠（60 mg／kg）腹腔注射麻醉。将连有压力换能器的聚乙烯导管（直径0.5 mm）经右颈外静脉插入右心室及肺动脉，用MedLab多导生理记录仪分别记录右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）和平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure，mPAP）。

1.2.3 组织标本采集与处理 血流动力学数据检测完毕后，颈动脉采血后处死大鼠，立即打开胸腔迅速分离心脏，置于预冷的PBS中洗涤干净，另取下大鼠右后肢胫骨。准确分离右心室、左心室加室间隔，准确称重，计算右心室（right ventricle，RV）／（左心室 ＋室间隔）（left ventricle（LV）＋septum（S））质量比；用游标卡尺测量胫骨长度，计算RV／胫骨长度比值。取右心室心尖部固定于4%多聚甲醛以备石蜡切片；准确称取100 mg右心室置于液氮中研磨后加入 Trizol（1 m1），-80℃冰箱保存，用于相关指标mRNA表达水平检测；剩余右心室置于液氮中研磨后加入组织裂解液冰上裂解 30 min，12 000 r／min，4℃离心10 min，提取蛋白，用于相关指标蛋白表达水平的检测。

1.2.4 右心室组织病理学及胶原沉积的观察 取大鼠右心室心尖部以4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋切片，行HE及Masson染色，分别观察右心室病理变化及胶原沉积情况。Masson胶原染色按试剂盒说明书进行。

1.2.5 生化指标测定 用DTX880多功能酶标仪分别检测右心室T-AOC及MDA含量。BCA法测定组织蛋白浓度。

1.2.6 免疫组化检测右心室NOX4蛋白表达 右心室石蜡切片，厚度约4μm，常规脱蜡至水，抗原修复液修复20 min，封闭液室温封闭1 h，抗NADPH氧化酶（NADPH oxidase 4，NOX4）一抗（1∶200）4℃过夜，二抗（1∶200）室温孵育 2 h，SABC室温孵育 1 h，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片观察。结果判断：NOX4主要定位于细胞浆。阳性细胞表达呈黄至棕黄色颗粒。

1.2.7 Real time PCR检测右心室 NOX4、collagenⅠ和collfagenⅢ mRNA的表达 用Trizol等试剂提取组织总RNA后，按逆转录试剂盒操作步骤进行RT反应。所得cDNA在实时荧光定量PCR仪（7300 Real Time PCR System，Applied Biosystem）上进行反应。按照说明，使用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，以2μl cDNA为模板，以 GAPDH为内参照，PCR扩增基因片段。引物如表1。PCR反应参数设置参照我们前期的研究方法［14］。数据分析用7300 System SDSSoftware软件，统计ΔΔCt值，计算RQ值以比较各组mRNA的表达。

Tab.1 Primer sequences used for amplification AR，collagenⅠand collagenⅢcDNA

1.2.8 Western blot检测右心室 NOX4、collagenⅠ和collagenⅢ蛋白表达 低温提取右心室蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每孔上样 50μg蛋白，12%SDSPAGE分离样品，转膜，封闭，分别滴加 GAPDH（1∶2 000）、NOX4（1∶500）、CollagenⅠ（1∶1 000）和 CollagenⅢ（1∶1 000）一抗 4℃过夜。洗膜，相应二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。洗膜后将高灵敏的LunimataTM Crescendo发光剂加到膜的正面，暗室曝光、压片、显影。胶片扫描后用Image J 1.43（National Institutes of Health）软件进行灰度值分析并比较各组蛋白表达差异。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠血流动力学指标的影响

与control相比，MCT处理组大鼠 RVSP、mPAP均显著升高（P＜0.01）。给予不同剂量吴茱萸次碱4周后，肺动脉高压大鼠RVSP、mPAP均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示吴茱萸次碱具有改善肺动脉高压血流动力学的作用（表2）。

Tab.2 Effect of rutaecarpine on RVSP and mPAP in monocrotaline-induced pulmonary hypertension of rats

2.2 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠RV／LV＋S及RV／胫骨长度比值的影响

因RV／LV＋S及RV／胫骨长度比值不受体重及左心室重影响，是评价右心室肥厚程度的主要指标。与control相比，MCT处理组 RV／LV＋S及 RV／胫骨长度的比值均显著升高（P＜0.01），提示野百合碱皮下注射诱导的肺动脉高压大鼠右心室明显增生肥大。给予不同剂量吴茱萸次碱4周后，上述比值均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明吴茱萸次碱具有抑制肺动脉高压右心室重构的作用（表3）。

Tab.3 Effect of rutaecarpine on RV／LV＋S and RV／Tibial length in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

2.3 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室组织形态学的影响

与control相比，MCT处理组右心室心肌细胞增生肥大且排列紊乱、稀疏和胞浆肿胀，心肌细胞间隙增宽，部分区域心肌纤维化增生。而给予不同剂量吴茱萸次碱4周后上述病理变化均有不同程度的改善（图 1）。

Fig.1 Effect of rutaecarpine on morphological changes of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension of rats（HE×400）

2.4 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室胶原表达的影响

Masson染色显示胶原纤维为蓝色，正常对照组右心室心肌细胞间隙清晰可见，血管旁胶原分布稀疏，着色较淡。与正常对照组相比，模型组大鼠右心室心肌细胞间质和血管旁有较多明显蓝色深染；与模型组相比，吴茱萸次碱各剂量组右心室心肌细胞间质和血管旁的蓝色深染逐渐减少，胶原沉积现象逐渐减轻，说明吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室心肌胶原沉积有一定的改善作用（图2）。经realtime PCR和Western blot检测发现，模型组大鼠右心室collagenⅠ和collagenⅢ mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），而给予不同剂量吴茱萸次碱4周后CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01，表 3，图 3、图 4）。

Tab.3 Effect of rutaecarpine on the collagen Iand collagen IIImRNA and protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

Fig.2 Effect of rutaecarpine on collagen accumulation of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension of rats（Masson’s trichrome stain×400）

Fig.3 Effect of rutaecarpine on the collagen I and collagen III proteins expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

Fig.4 Dissociation curve of collagenⅠ and collagenⅢ PCR product with real-time PCR

2.5 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室NOX4表达的影响

经real Time PCR、Western blot及免疫组化检测发现，模型组右心室NOX4 mRNA及蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，给药不同剂量吴茱萸次碱4周后均能不同程度下调大鼠右心室NOX4 mRNA及蛋白的表达（表 4，图 5、图 6）。GAPDH和NOX4基因PCR扩增产物熔解曲线分别在83℃和87℃左右处形成单一的荧光峰。说明 real-time PCR产物均具有特异性，无二聚体产生（图7）。

Fig.5 Expression of NOX4 protein in right ventricle was determined by immunohistochemisty staining（arrows indicated NOX4 positive staining）

Fig.6 Effect of rutaecarpine on the NOX4 protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

Fig.7 Dissociation curve of GAPDH and NOX4 PCRproduct with real-time PCR

Tab.4 Effect of rutaecarpine on the NOX4 mRNA and protein expression of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

2.6 吴茱萸次碱对肺动脉高压大鼠右心室T-AOC和MDA的影响

与control相比，模型组右心室 T-AOC明显降低、MDA含量显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，与模型组相比，给药不同剂量吴茱萸次碱4周后右心室T-AOC明显增高、MDA含量显著下降。提示吴茱萸次碱具有一定的抗氧化作用（P＜0.05，P＜0.01，表 5）。

Tab.5 Effect of rutaecarpine on the T-AOC and MDA of right ventricle in monocrotaline-induced pulmonary hypertension rats

3 讨论

心室重构是指心肌细胞受到外界和内在刺激时为维持正常心功能作出的适应性反应［9］。PH时由于肺循环的压力和阻力增加，可出现右心室负荷增大、右心功能不全，严重时可导致右心室重构，主要表现为右心室肥大、心肌充血水肿、心肌灶性肌浆凝结，心肌间质纤维化并伴有少量中性粒细胞浸润等［2］。本实验结果显示，MCT诱导的 PH大鼠RVSP、mPAP、RV／（LV＋S）、RV／胫骨长度和右心室胶原沉积及collagen I、collagen III的表达均显著增高；右心室HE染色结果显示，右心室心肌细胞出现排列紊乱，心肌细胞肥大、稀疏和胞浆肿胀，部分区域心肌纤维化增生。以上结果表明，野百合碱诱导的PH大鼠右心室明显重构，与文献报道一致［3］。

传统中药吴茱萸属芸香科植物，在临床应用己有数千年历史，具有广泛的药理学效应，如舒张血管、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗炎、抗肿瘤等。吴茱萸次碱（Rut）是从中药吴茱萸中提取的一种吲哚喹唑啉类生物碱。整体、离体及细胞水平的实验证据均表明，Rut具有显著的心血管保护效应，如舒血管、降压、保护心肌缺血／再灌注损伤及减轻异丙肾上腺素诱导的心肌重构等作用［5-7］。本实验研究结果显示，Rut连续给药4周后，PH大鼠的RVSP、mPAP、RV／（LV＋S）、RV／胫骨长度和右心室胶原沉积及collagen I、collagen III的表达均显著降低，右心室病理损伤明显减轻。提示Rut对PH大鼠具有降低肺动脉压力、减轻右心室肥厚和纤维化的作用。

肺动脉高压右心室重构的发生机制尚未完全阐明，氧化应激在肺动脉高压右心重构中发挥了重要的作用［3］。在PH右心重构的动物模型中，可观察到右心组织氧化应激水平显著增高［10］，而抑制过度的氧化应激损伤能够改善肺动脉高压及右心重构［11，12］。大量研究表明NOX诱导的氧化应激在肺血管重构以及右心重构中起着重要作用［13-15］。最新研究发现，白藜芦醇及其衍生物通过抑制NOX2及NOX4的表达而抑制低氧诱导的肺动脉高压右心室重构［4］。本研究发现野百合碱诱导的PH大鼠右心室NOX4的表达显著增高，MDA含量明显升高而T-AOC显著降低。而给予Rut 4周后，PH大鼠右心室NOX4表达显著降低，MDA含量明显减少，T-AOC含量显著升高。表明提示吴茱萸次碱可能通过抗氧化，下调NOX4的表达对PH大鼠右心室重构具有一定的保护作用。但也有文献报道，心肌NOX2的表达升高也参与了肺动脉高压右心室重构的发生与发展［4］，而吴茱萸次碱是否通过下调NOX2的表达而产生心脏保护作用有待进一步研究。

综上所述，吴茱萸次碱能够缓解野百合碱诱导的PH大鼠右心室重构，其机制可能与其抑制NOX4的表达，进而降低氧化应激损伤有关，从而为扩大吴茱萸次碱的临床应用提供了实验支持和理论依据。

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