间歇低压低氧预处理对心肌缺血／再灌注损伤及ZFP580表达的影响*

孟祥艳，于海龙，郭 敏，张文成，徐瑞成

（1.武警后勤学院生理学与病理生理学教研室，天津300309；2.武警后勤学院附属医院，天津300162；3.天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津300309）

随着心肌梗死后溶栓或介人治疗、冠状动脉旁 路、心脏移植术等医疗技术的发展，心肌缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤的临床发生率日益增加，并成为心血管病人死亡的首要原因［1］，探讨I／R损伤的发生机理并积极寻求其防治手段成为亟待解决的问题。

间歇低压低氧（intermittent hypobaric hypoxia，IHH）预处理即间断性多次短时间暴露于一定海拔高度的低氧环境而大部分时间处于常氧水平。研究表明，IHH预处理能预防应激、缺血／缺氧及缺血再灌注损伤等对心肌造成的损伤，产生与缺血预处理类似的保护作用，增强心肌对于缺血、缺氧的耐受性，保护心脏免受持续性低氧及缺氧／复氧的损害［2，3］。尽管IHH预处理已逐步成为临床医学、高原医学和航空医学等领域的研究热点，然而由于其确切的保护机制至今尚未完全阐明，IHH预处理仍然存在着临床应用的难题。进一步揭示IHH抗心肌细胞缺氧性损伤的分子机制，对于寻找能模拟IHH保护效应的药物或其他救治手段具有重要的临床意义。

ZFP580是本研究室克隆的一种新的C2H2型锌指核转录蛋白，ZFP580广泛存在于大鼠细胞内，并在心肌细胞、内皮细胞的表达量最高［4］。前期实验研究证明其可能参与维持细胞的正常功能，对于细胞的存活、增殖等生理活动具有明显意义［5，6］。在大鼠心肌I／R损伤过程中，L-精氨酸预处理可明显上调大鼠心肌组织中ZFP580的表达并发挥细胞保护作用［7］。

本实验旨在通过大鼠心肌I／R损伤模型探讨IHH预处理对大鼠心肌I／R后改善心肌损伤，减少心肌梗死面积的作用及锌指核转录因子ZFP580的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性Wistar大鼠32只，初始体重为100～130 g，购自军事医学科学院动物中心。大鼠随机分为间歇低压低氧（IHH）预处理组和常氧对照（Nor）组。IHH组大鼠16只，置于模拟海拔高度为5 000 m的低压氧舱中（PB＝404 mmHg，54 kPa；PO2＝84 mmHg，11.3 kPa）每天6 h，持续42 d。NOR组大鼠16只，于常氧环境下饲养42 d，各组大鼠饲养42 d后体重增长至 380～410 g。

1.2 实验材料

大鼠H9c2心肌细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。CK-MB含量 ELISA检测试剂盒（R＆D），LDH活力试剂盒（南京建成），胎牛血清（Gibco），高糖 DMEM（Hyclone），模拟缺血的缺氧培养基配方（mmol／L，pH 6.2）：1.0 KH2PO4，10.0 NaHCO3，1.2 MgCl2·6H2O，25.0 HEPES，74.0 NaCl，16.0 KCl，1.2 CaCl2，20.0 Na lactate。ZFP580一抗（Abcam），β-actin一抗（Sigma），Annexin V-PE／7-AAD染色试剂（Invetrogen），其余试剂为国产分析纯。

1.3 大鼠心肌I／R损伤模型制备

用25%乌拉坦（4 ml／kg）腹腔内注射麻醉，气管切开并插管，连接于小型动物呼吸机，调节呼吸频率为 80～90 beats／min，潮气量 1 ml／100 g。开胸暴露心脏，用小圆针穿5／0号丝线，在肺动脉圆锥右缘、平左心耳间冠状静脉走行处下缘2～3 mm浅层心肌进行穿线，在心肌表面沿血管走行方向垫一硬质塑胶管（直径2 mm，长1 cm），连同塑胶管一同结扎，造成冠状动脉阻塞。冠状动脉结扎30 min后，自线结处剪断丝线，恢复血流，实现冠状动脉再灌注，建立心肌I／R损伤模型。实验过程中记录大鼠肢体Ⅱ导联心电图，以ST段明显抬高和／或T波高耸作为冠状动脉结扎成功的标志，抬高的ST段回落1／2以上标志冠状动脉恢复血液灌注。

1.4 大鼠血清中心肌酶的测定

各组大鼠心肌缺血后再灌注2 h，自腹主动脉取血，用枸橼酸抗凝，3 000 r／min离心 10min后，取上层血清。按照试剂盒说明测定各组动物血清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性及肌酸肌酶同功酶（creatine kinase cardiac isoenzyme，CK-MB）含量。

1.5 酞菁蓝-TTC染色测定心肌梗死面积

IHH预处理组和Nor组另外8只大鼠心肌缺血后再灌注2 h，采用在体心肌组织酞菁蓝-TTC（triphenyltetrazolium chloride，2，3，5－氯化三苯基四氮唑）染色法测定心肌梗死面积。具体方法为：将冠状动脉在原结扎点结扎后，沿右颈总动脉快速注射4%酞菁蓝1 ml，1 min后立即取出心脏，-80℃冰冻10 min。沿心脏长轴方向以1～2 mm间隔切成5片心肌横断面切片，将心肌切片放入1%TTC溶液（pH 7.4），37℃孵箱中孵化30 min，数码相机拍照。酞菁蓝是一种蓝色染料，可以将非缺血区染成蓝色；而TTC是一种脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，能与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色化合物，从而使有活力的细胞呈现红色。因此，未被染蓝的危险区中被染成红色的区域为非梗死区，不着色（呈苍白色）的区域为梗死区。上述采集的数码图像，通过Image-ProPlus 6.0软件分析计算梗死面积与危险区面积的比值（infarct area／area at risk，IA／AAR）

1.6 H9c2大鼠心肌细胞的培养及模拟缺血／再灌注损伤模型的建立

H9c2心肌细胞于含有10%胎牛血清的高糖DMEM，37℃恒温培养箱 （5%CO2）孵箱中培养，隔天换液，3 d传代一次，传代4～5次后进行后续实验。各组细胞在实验前8～12 h利用无血清DMEM饥饿使细胞同步化。实验分为：（1）模拟缺血／再灌注（simulated ischemia／reperfusion，SI／R）组：H9c2心肌细胞换用缺氧培养基（提前用氮气饱和30 min）后，置入缺氧装置后密闭。然后从进气口充入混合气（95%N2＋5%CO2），持续通气。持续缺氧3 h后，将细胞换用无血清高糖DMEM培养基继续置于37℃恒温培养箱中继续培养2 h，实现复氧；（2）对照（Control）组：细胞换用无血清高糖DMEM培养基于37℃恒温培养箱中持续培养5 h。

1.7 慢病毒介导的ZFP580基因转染

重组表达ZFP580全长基因的慢病毒载体颗粒（lenti-ZFP580），并设空载体（lenti-NC）为阴性对照。按照感染复数（MOI值）200感染H9c2心肌细胞。慢病毒载体转入H9c2心肌细胞72 h后，提取心肌细胞总蛋白，通过Western blot方法检测ZFP580表达情况。慢病毒介导的基因转染实验在H9c2心肌细胞SI／R实验前72 h进行。

1.8 Annexin V-PE／7-AAD染色及流式细胞术检测H9c2细胞凋亡

采用流式细胞术以Annexin V-PE／7-AAD染色法检测H9c2心肌细胞凋亡情况。各组细胞用胰蛋白酶消化后，调整浓度至1×106cells／ml细胞悬液，经预冷的PBS洗涤后分别用PE标记的Annexin V和7-AAD进行染色，随后采用流式细胞仪进行凋亡细胞的计数及分析。细胞早期凋亡时，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧并与Annexin V结合；细胞晚期凋亡时，细胞膜已不完整，7-AAD能够透过细胞膜进入细胞而使细胞核染红。据此原理，Annexin V与7-AAD染色可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

1.9 Western blot检测ZFP580表达情况

提取各组大鼠心肌组织及H9c2心肌细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白质浓度，将样品与SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸10 min使蛋白变性。取60μg总蛋白上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭后，加入一抗（按1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000稀释），室温摇床上孵育2 h，充分漂洗后按ECL发光试剂盒说明书操作，曝光后x光片用凝胶图像分析软件扫描，测定蛋白条带的灰度值。ZFP580表达结果用实测值与内参β-actin的比值表示。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 IHH预处理可明显降低 I／R后大鼠血清中LDH及CK-MB的含量

各组大鼠心肌I／R损伤后，血清中CK-MB含量及LDH活性均较sham组明显升高。与Nor组大鼠相比较，IHH预处理组大鼠心肌I／R损伤后，血清中CK-MB含量及LDH活性升高程度较轻，并低于Nor组大鼠I／R损伤后血清中CK-MB及LDH水平（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Comparison of LDH activity and CK-MB concentration in the plasma of each group，n＝8）

Tab.1 Comparison of LDH activity and CK-MB concentration in the plasma of each group，n＝8）

I／R：Ischemia／reperfusion；Nor：Normoxia group；IHH：Intermittent hypobaric hypoxia；LDH：Lactate dehydrogenase；CKMB：Creatine kinase cardiac isoenzyme*P＜0.05 vs sham；＃P＜0.05 vs I／R in Nor

Group LDH（U／L） CK-MB（U／L）Sham in Nor 223.7±14.6 108.8±7.8 I／R in Nor 312.5±16.8* 194.6±10.3*Sham in IHH 245.2±8.7 126.6±11.2 I／R in IHH 287.3±14.5＃ 162.4±9.6＃

2.2 IHH预处理可明显缩小I／R后心肌梗死面积

经酞菁蓝-TTC在体染色后，在大鼠心肌组织横截面能清晰区分出白色梗死区，红色缺血区及蓝色非缺血区。经IHH预处理大鼠在心肌I／R损伤后，大鼠心肌梗死面积占左室缺血区面积的比值（%）为（13.94±2.01）%，较 NOR组（30.57±5.11）%明显缩小（P＜0.05，图 1）。

Fig.1 Size comparison of I／R induced myocardial infarct between rats in normoxia and IHH preconditioning groups（n＝8）A：Rat heart slices stained with 10%TTC；B：Infarction percentage of the area at risk；Nor：Normoxia；IHH：Intermittent hypobaric hypoxia；I／R：Ischemia／reperfusion

2.3 Western blot实验检测结果

各组大鼠心肌组织中ZFP580蛋白表达的结果显示，Nor组及IHH预处理组大鼠在心肌I／R损伤后，心肌组织中ZFP580蛋白表达水平均较相应sham组下调（0.76±0.08-fold vs 1，1.36±0.12-fold vs 1.68±0.2-fold）。然而，经 IHH预处理的大鼠心肌I／R损伤后，心肌组织中ZFP580蛋白表达水平明显高于 NOR组（1.36±0.12-fold vs 0.76±0.08-fold，P＜0.05，图2）。对 H9c2心肌细胞中 ZFP580表达检测结果发现，转染病毒载体Lenti-ZFP580后H9c2心肌细胞中 ZFP580表达明显上调（1.98±0.26-fold vs 1，P＜0.05，图 3A）

Fig.2 Levels of ZFP580 protein in myocardium of rats with or without I／R in normoxia and IHA hypoxia groups（n＝8）Nor：Normoxia group；IHH：Intermittent hypobaric hypoxia；I／R：Ischemia／reperfusion

2.4 ZFP580对H9c2心肌细胞凋亡的影响

各组心肌细胞在基因转染72 h后进行SI／R损伤实验，经流式细胞仪均可检测到凋亡细胞。转染病毒载体Lenti-ZFP580后高表达ZFP580的H9c2心肌细胞在 SI／R损伤后细胞凋亡率为（11.9±2.3）%，明显低于转染空载体Lenti-NC的阴性对照组（21.07±1.5）%（P＜0.05，图 3B）。

3 讨论

早在上世纪50年代末，人们第一次发现生活在高海拔地区的人群心肌梗死的发生率明显低于生活在平原的人群［8］。随后，有关缺氧具有心肌保护作用的研究在动物实验水平逐渐开展，人们利用低压低氧舱模拟高海拔地区缺氧环境进行了大量的研究，并最终证实了IHH的心肌保护作用，验证了这一流行病学观察结果［9］。然而，对于IHH是如何发挥心肌保护作用的，仍是困扰人们的一大难题。本实验按照文献报道的方法［10］模拟低压低氧环境，大鼠在此环境适应42 d后进行心肌I／R损伤实验，实验中发现IHH预处理大鼠心肌对于I／R损伤的耐受性明显增强，表现在心肌I／R损伤后心肌梗死面积缩小以及血清中心肌酶的漏出减少。实验证明本实验采用的IHH预处理对于大鼠心肌I／R损伤具有明显心肌保护作用，然而其发挥保护作用的机制仍需进一步的实验论证。

Fig.3 SI／R-induced apoptosis assay determined by annexin V／7-AAD staining and flow cytometry analysis

本组在先前的工作中获得了一个人类心血管疾病相关新基因ZNF580（Genbank注册号：AF184939），并随后获得了鼠源性同源基因ZFP580。在前期对于ZFP580／ZNF580基因功能研究的实验中发现，其编码一种具有调控作用的C2H2型锌指核转录因子，对维持细胞的存活、增殖等生理活动具有明显意义。本实验中发现，经IHH预处理后大鼠心肌组织中ZFP580的表达明显上调，IHH预处理明显抑制心肌I／R损伤导致的心肌组织中ZFP580表达的下降。由此，我们设想ZFP580是否参与了IHH低氧预处理抗心肌I／R损伤的过程，并发挥一定的心肌细胞保护作用。凋亡和坏死是缺血心肌再灌注后导致细胞死亡的两种方式，有研究认为心肌缺血导致的细胞死亡方式以坏死为主，而再灌注后导致的细胞死亡形式则多为凋亡，细胞凋亡是心肌I／R后引发心肌细胞损伤的重要环节［11］。也有研究表明细胞凋亡是影响病人预后的主要因素，而减少或抑制I／R后心肌细胞凋亡能明显减少心肌梗死面积，提高心肌收缩功能，从而发挥心肌保护作用［12］。为了进一步探讨转录因子ZFP580在I／R诱导心肌细胞凋亡中发挥的作用。本研究通过慢病毒介导的基因转染实验观察了ZFP580不同表达水平的心肌细胞在SI／R损伤后细胞凋亡的情况。实验发现，ZFP580高表达的H9c2心肌细胞在SI／R损伤后细胞凋亡率明显低于转染空载体的阴性对照组细胞。据此我们推断，ZFP580可能作为细胞内源性抗凋亡机制之一在心肌I／R后发挥细胞保护作用。

总之，本实验通过大鼠心肌I／R损伤模型，证实了IHH预处理对于I／R所致心肌损伤的保护作用，并观察到锌指核转录因子ZFP580在IHH预处理大鼠心肌中表达上调；通过慢病毒介导的基因转染实验获得高表达ZFP580的心肌细胞，并证实心肌细胞高表达ZFP580后对于SI／R损伤具有更强的耐受性，明显降低了细胞的凋亡率。由此可见，ZFP580可能作为心肌细胞内源性抗凋亡机制之一，参与IHH预处理对抗心肌I／R损伤的过程，然而ZFP580参与抗凋亡的具体机制及其信号转导通路仍值得我们进一步研究。

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