富硒板党对老龄大鼠免疫功能的影响及其机制*

王先丽，陈龙菊

（湖北民族学院医学院，恩施445000）

富硒板党（Rich Selenium-Banqiao-Codonopsis Pilosula，BCPA）因出产于素有“中国硒都”之称的湖北恩施板桥境内而得名。1981年在全国药材品种质量鉴定会上定名为“中国板党”，简称“板党”。研究表明BCPA富含多糖、皂苷，具有抗缺氧、抗炎、抗疲劳及抗衰老等作用［1-5］。BCPA在促进健康，抗衰老及增加免疫力而倍受重视，然其内在机制并不明确。本研究以不同年龄段的大鼠为对象，观察BCPA注射液对老龄大鼠免疫功能的影响，探讨其免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄、12月龄和 22月龄 SPF级 Wistar大鼠（雌雄各半），由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。分别作为年轻组、中年组、老龄组。每个年龄段大鼠随机分为对照组和BCPA实验组（n＝10）。

1.2 实验药品与仪器

小鼠抗大鼠IgGl、IgG2α及山羊抗兔IgG（晶美公司），刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），胎牛血清（fetal calf serum，FCS）及钥孔虫戚血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）（Sigma公司），PE（藻红蛋白）标记抗大鼠CD3、CD8抗体及FITC（异硫氰酸荧光素）标记抗大鼠 CD4、CD44抗体（Biolegend公司），TMB（四甲基联苯胺）过氧化物酶底物及HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）（大连宝生物），DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）细胞培养液（美国Gibco公司），注射佐剂明矾（Thermo Scientific公司），其它化学试剂为国产分析纯试剂（湖北恩施乐之塬科技公司）。精密电子天平（上海天平仪器厂），全自动酶标仪（美国Thermo公司），低温冷冻离心机（美国Beckman公司）、流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.3 富硒板党（BCPA）注射液

BCPA购自恩施板桥乡中药材生产基地，采用水提醇沉法制成含生药30%（相当于生药含量2 g／ml）的液体，用时以生理盐水稀释成0.4 g／ml，瓶装密封消毒贮存于4℃备用。

1.4 BCPA给药及免疫注射

各年龄段组大鼠自由进食、饮水，BCPA实验组每天腹腔按7.2 g／kg注射BCPA，对照组注射等量生理盐水，常规饲养连续45 d。1 mg／ml的KLH与1%佐剂按1∶3充分混匀用于免疫注射，在BCPA给药后的第15天，按250μg／kg体重对大鼠进行皮下注射［6，7］。

1.5 迟发型免疫应答的诱导

BCPA给药后的第22天，使用微米千分尺测量各年龄组大鼠左、右耳的厚度（精确到μm）。后将KLH用磷酸缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）配制成1μg／ml使用液，每只大鼠右耳皮内注射20μl，左耳注射20μl PBS。注射后12 h、24 h再分别测量各组大鼠耳的厚度，按△注射KLH的耳朵厚度-△注射PBS的耳朵厚度，△＝注射后的耳朵厚度-注射前的耳朵厚度，作为迟发型免疫（delayed-type hypersensitivity，DTH）应答的计算公式［6，7］。

1.6 KLH抗原特异性IgG、IgG1及IgG2α检测

BCPA给药前、给药后的第15天、30天及45天尾静脉采集各年龄组大鼠血液，置于促凝管中，4℃，10 000 r／min离心12 min，于-80℃保存备用。KLH抗原特异性IgG、IgG1及IgG2α的ELISA检测方法及实验步骤参考文献［6，7］。

1.7 脾细胞中主要T细胞亚群的分析

麻醉大鼠后经75%乙醇消毒，打开腹部小心取出脾脏，剪除周围结缔组织，放入培养皿中，加入10 mmol／L PBS缓冲液（pH 7.4）反复冲洗后转至 200目滤网培养皿中，仔细研磨制成单个细胞悬液。2 000 r／min离心12 min，弃上清后加入5 ml红细胞裂解液，1 500 r／min离心 8 min，再弃上层清液，重复 3次。沉淀用无血清DMEM培养液离心洗涤3次后重悬于PBS缓冲液，调整细胞浓度为2×107celles／ml，台盼蓝（Trypan Blue）细胞活性检测。依据检测的T细胞亚群的不同，加入50μl稀释后的用PE标记抗大鼠CD3、CD8及用FITC标记抗大鼠CD4、CD44一抗1μg在相应的流式细胞检测管中，对照管则加入50μl缓冲液。各管再分别加入50μl细胞悬液混匀4℃孵育半小时，离心洗涤3次，取500μl用于流式细胞仪检测。

1.8 脾细胞增殖实验

脾细胞获取后（采集方法同上）将沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中，调整细胞浓度为 1×106cells／ml，台盼蓝（Trypan Blue）细胞活性检测。将上述细胞加入96孔细胞培养板中，每个标本设3个孔，每板设阴性对照。分别加入T细胞有丝分裂原 ConA（10μg／ml）、B细胞有丝分裂原 LPS（5 μg／ml）及特异性抗原 KLH（100μg／ml）参考文献［6，7］于CO2培养箱孵育后，在490 nm波长下检测吸光度。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 DTH反应

对不同年龄段BCPA实验组与对照组大鼠诱发DTH实验结果表明：12、24 h的 DTH应答，年轻、中年组大鼠BCPA实验组与对照组DTH反应均无显著差异。老龄大鼠BCPA实验组DTH反应相对对照组而言则明显增强（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 DTH responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（μm，，n＝10）

Tab.1 DTH responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（μm，，n＝10）

DTH：Delayed-type hypersensitivity*P＜0.05 vs aged rats control group

Group 12 h 24 h Young rats control 118±49 147±35 Young rats BCPA 140±32 145±42 Middle-aged rats control 217±44 108±28 Middle-aged rats BCPA 231±49 128±53 Aged rats control 46±24 76±22 Aged rats BCPA 227±61* 156±25*

2.2 KLH抗原特异性 IgG、IgG1及 IgG2α抗体分析

不同年龄段BCPA实验组及对照组的抗KLH特异性抗体分析结果如表2所示：特异性IgG、IgG1及IgG2α抗体年轻BCPA实验组与对照组之间无显著性差异；中年BCPA实验组较对照组IgG1有显著增高现象（P＜0.05），但 IgG、IgG2α无显著性差异；老龄组三种特异性抗体BCPA实验组较对照组都有明显增高现象（P＜0.05），表明BCPA能有效提高老龄大鼠的免疫功能及对抗原的应答反应。

2.3 BCPA对脾细胞中主要T细胞亚群的影响

运用流式细胞仪对各年龄段大鼠脾细胞CD3＋T淋巴细胞、CD8＋细胞毒性T淋巴细胞、CD4＋辅助T淋巴细胞和CD44＋记忆性T淋巴细胞分析，结果表明：CD8＋细胞毒性T淋巴细胞在年轻、中年BCPA实验组较对照组无明显变化；CD3＋T淋巴细胞、CD4＋辅助T淋巴细胞年轻组无显著差异，但在中年组、老龄组中有显著变化（P＜0.05）；CD44＋记忆性T淋巴细胞中年BCPA实验组较对照组有明显升高现象（P＜0.05，表 3）。

Tab.2 Anti-KLH IgG，IgG1 and IgG2α isotype responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（，n＝10）

Tab.2 Anti-KLH IgG，IgG1 and IgG2α isotype responses of young，middle age and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group Time（d） IgG（OD） IgG1（OD） IgG2α（OD）Young rats control 0 0.48±0.04 0.22±0.02 0.35±0.02 15 0.46±0.11 0.23±0.02 0.34±0.03 30 1.21±0.23 1.51±0.11 0.76±0.12 45 0.91±0.29 1.68±0.12 0.81±0.09 Middle-aged rats control 0 0.48±0.05 0.23±0.01 0.34±0.01 15 0.47±0.12 0.21±0.02 0.32±0.02 30 1.12±0.24 1.48±0.09 0.85±0.09 45 0.87±0.31 1.56±0.13 0.82±0.08 Young rats BCPA 0 0.48±0.05 0.21±0.01 0.36±0.02 15 0.47±0.09 0.22±0.02 0.37±0.01 30 0.87±0.13 0.46±0.11 0.45±0.05 45 1.22±0.23 0.56±0.12 0.57±0.06 Middle-aged rats BCPA 0 0.46±0.04 0.19±0.02 0.38±0.03 15 0.47±0.08 0.21±0.03 0.39±0.02 30 0.89±0.15 1.12±0.21*0.58±0.14 45 1.26±0.25 1.71±0.32*0.86±0.15 Aged rats control 0 0.35±0.03 0.09±0.01 0.26±0.03 15 0.39±0.07 0.12±0.02 0.27±0.02 30 1.18±0.15 1.46±0.09 1.37±0.12 45 1.43±0.13 1.86±0.08 1.52±0.16 Aged rats BCPA 0 0.36±0.04 0.11±0.02 0.28±0.05 15 0.35±0.08 0.13±0.02 0.29±0.04 30 1.42±0.13*2.24±0.11*1.58±0.17*45 1.85±0.12*2.18±0.07*2.13±0.23*

Tab.3 Flow cytometry assays of cellular composition of splenocytes fromyoung，middle-age rats and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（cells／makers，，n＝10）

Tab.3 Flow cytometry assays of cellular composition of splenocytes fromyoung，middle-age rats and aged rats in control groups or BCPA experimental groups（cells／makers，，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group CD3＋ CD8＋ CD4＋ CD44＋Young rats control 40.8±1.4 21.8±1.3 20.7±1.4 40.8±1.6 Young rats BCPA 42.1±1.9 22.4±2.1 24.2±2.4 43.1±1.7 Middle-aged rats control 35.6±1.6 20.7±1.9 18.8±1.0 34.2±1.4 Middle-aged rats BCPA 41.5±1.2* 22.8±1.1 23.2±0.7* 42.1±1.2*Aged rats control 36.7±1.5 23.2±2.2 17.9±0.8 35.8±2.1 Aged rats BCPA 44.6±2.4* 24.5±2.5 20.6±1.5*42.1±2.6

2.4 BCPA对脾细胞中增殖的影响

脾细胞悬液在特异性抗原 KLH、T细胞丝裂原ConA和B细胞丝裂原 LPS作用下增殖，结果表明：特异性抗原KLH、T细胞丝裂原ConA及B细胞丝裂原LPS对年轻BCPA实验组脾细胞有很强的增殖反应（P＜0.05），增殖反应在中年、老龄 BCPA实验组和对照组之间无明显变化（表4）。

3 讨论

衰老是生物自发必然的生理现象，可表现为结构上的退行性变，机能的衰退，适应性及抵抗力下降，目前对衰老有多种假说，其中之一为免疫学说［6］。免疫衰老是极为复杂的过程，常常会伴随免疫学指标的改变，其机制目前尚不明确［7］。免疫衰老最常见的改变是T细胞和B细胞数量和功能的减退［8］，DTH应答功能会随年龄的增加而减退，其反应是衡量体内T细胞介导免疫反应的指标。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，在体液免疫及细胞免疫中也有重要作用［9］，免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）则是评价机体体液免疫状况的常用指标，其含量多少基本可反映机体免疫应答能力和体液免疫水平。

Tab.4 Proliferative responses of splenocytes from young，middleage rats in and aged rats in control group or BCPA experimental group（，n＝10）

Tab.4 Proliferative responses of splenocytes from young，middleage rats in and aged rats in control group or BCPA experimental group（，n＝10）

*P＜0.05 vs control group

Group KLH（OD） ConA（OD） LPS（OD）Young rats control 0.52±0.02 0.48±0.31 0.49±0.02 Young rats BCPA 0.61±0.03*0.64±0.18*0.62±0.01*Middle-aged rats control 0.46±0.03 0.47±0.04 0.48±0.06 Middle-aged rats BCPA 0.51±0.02 0.51±0.17 0.52±0.03 Aged rats control 0.47±0.02 0.42±0.05 0.49±0.04 Aged rats BCPA 0.49±0.04 0.47±0.03 0.53±0.01

本研究中老龄组BCPA实验组DTH反应明显增强，提示BCPA有利于增强T细胞介导的免疫反应，具有抵抗免疫衰老的特征，可以减少因免疫衰老所致个体的发病率及死亡率，表明BCPA能有效增强T淋巴细胞的活性，促进其增殖、分化，与詹光杰［10］研究一致；KLH是一种海洋原始腹足类 Megathura crenulata血淋巴液中的呼吸蛋白，它可显著刺激人和动物的免疫功能，具有很好的激活作用，常做免疫增强剂［11］。特异性抗原KLH实验结果表明BCPA能促进老龄大鼠产生相应的 IgG、IgG1及 IgG2α抗体，虽在年轻组中不明显，但能显著促进老龄大鼠的体液免疫应答能力、增强体液免疫功能，尤其是IgG1及IgG2α水平的显著提高表明能够促进Th1和Th2型免疫应答；CD4＋辅助T淋巴细胞、CD3＋T淋巴细胞在老龄大鼠中明显升高，表明BCPA可以改善老龄大鼠的脾脏功能，影响T细胞亚群的比例，具有调节机体免疫平衡的功能，钟灵［12］等研究认为板党多糖通过提高机体抗氧化能力，抑制自由基对胰岛β细胞的破坏而增强免疫力，其内在机制还待进一步研究；尹剑春［13］认为由ConA诱导引起脾细胞的增殖能反应T细胞的功能状态，可用来观察机体免疫功能，在本实验中BCPA能有效促使年轻组大鼠脾细胞增殖，然而中年组和老龄组大鼠脾细胞增殖不明显，说明随年龄的增长，机体免疫能力出现了下滑，另一方面表明BCPA或许不是通过细胞增殖的途径来改善老龄群体体液和细胞免疫功能的。

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