厄洛替尼对胰腺癌细胞侵袭力的影响及机制

于锦萍，石国刚，张秀艳，王 林，陈 红，房 芳

(1唐山市工人医院分院，河北唐山063000;2遵化市人民医院;3河北联合大学附属医院;4唐山市工人医院)

胰腺癌术后转移是胰腺癌手术切除治疗的难点。研究显示，胰腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的阳性率接近50%，其参与了胰腺癌的发生、发展和转移［1］。2003～2008年，我们观察了厄洛替尼对胰腺癌细胞生长、侵袭的影响及其相关因子核转录因子NF-κB的表达变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海细胞生物学研究所。MTT购于美国Sigma aldrich公司，RAD001用二甲基亚砜(DMSO)配制成1 mmol/L贮备液，实验时用RPMI1640培养液稀释至所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法检测细胞增殖情况 调节PANC-1细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板中，根据厄洛替尼的药物浓度分为0、5、25、50 μmol/L四个浓度组，每组设6个复孔，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 mL，37℃孵育4 h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150 mL DMSO，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞生长抑制率，抑制率=［(空白对照组OD值－各实验组OD值)/空白对照组OD值］×100%。

1.2.2 Transwell检测细胞侵袭力 实验分为空白对照组、EGF(表皮生长因子)组、厄洛替尼组、EGF联合厄洛替尼组。EGF、厄洛替尼作用浓度分别为10 ng/mL、4 μmol/L，联合组为 EGF 先作用 24 h 后再加厄洛替尼作用4 h。分别收集各处理组的PANC-1细胞培养上清液，置于8 μm孔径的 Transwell板中，于半透膜上层加入2×105PANC-1细胞系。4 h后于显微镜下计数每个高倍视野平均细胞数。

1.2.3 Western blot检测 NF-κB 蛋白表达 收集各组细胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min离心10 min，取上清测定浓度后 －80℃保存备用。SDS-PAGE电泳分离，完毕后将蛋白转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂奶粉封闭，后放入含一抗的TBST溶液，4℃过夜，洗膜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1 h，目标蛋白质用DAB显色。计算机扫描，以GAPDH蛋白做参照，分析处理。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，结果以±s表示，组间比较采用两样本均数的t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度厄洛替尼对PANC-1细胞生长的影响 PANC-1细胞生长抑制率随厄洛替尼浓度增加明显升高，并且各个浓度的细胞抑制率差别均有统计学意义(P均＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度厄洛替尼对PANC-1细胞的生长抑制率比较

2.2 厄洛替尼对PANC-1细胞侵袭力影响 Transwell试验结果提示，对照组、EFG组、厄洛替尼组、EGF+厄洛替尼组的PANC-1细胞数分别为(57.0±12.79)、(167.4 ±12.32)、(56.2 ±7.97)、(167.4±12.32)个，厄洛替尼组和EGF+厄洛替尼组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 厄洛替尼对NF-κB表达的影响 Western blot结果显示，对照组、EFG组NF-κB蛋白表达量升高;厄洛替尼组、EGF+厄洛替尼组降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图1 Western blot检测各组NF-κB表达

3 讨论

胰腺癌早期很难发现，临床确诊时多为晚期，仅10% ～20%的患者有手术根治切除的机会［2，3］。进展期胰腺癌的治疗目前尚无理想的化疗药物，肿瘤细胞的快速增生、转移及对放化疗抵抗仍是目前胰腺癌治疗的难点［4］。侵袭和转移是胰腺癌患者死亡的主要原因，EGFR在这一过程中起重要作用［5］。EGFR与配体结合后发生二聚化，随后受体二聚体内发生自身磷酸化和转磷酸化作用，使羧基端特异性的酪氨酸残基磷酸化，进而调节细胞的生长、分化和增殖等［6］。厄洛替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，主要通过与三磷酸腺苷竞争结合至EGFR胞内酪氨酸激酶功能域，抑制受体自磷酸化而阻止下游信号传导，从而抑制细胞周期进程，加速细胞凋亡，抑制血管生成，发挥抗肿瘤作用［7］。本研究结果显示，厄洛替尼可以抑制胰腺癌的生长，并呈浓度依赖性，其抑制作用随浓度增加而增强。

NF-κB因子广泛存在真核生物中，是一种重要的细胞内信号因子，其结构是由P50和P65组成的二聚体，调节许多与细胞生长和分化相关的基因表达［8，9］。它作为信号传导途径中的枢纽，与机体免疫和肿瘤的发生发展、细胞凋亡的调节以及胚胎发育等有密切联系［10］，是重要的核转录因子。研究表明，胰腺癌组织有较高的NF-κB活性及表达，这种高表达与胰腺癌的进展密切相关［11］。同时有研究证实，使用NF-κB抑制剂可以阻断NF-κB P65的表达及 NF-κB 的 DNA 结合活性［12］。张浩等［13］研究认为，EGF可通过上调NF-κB的表达促进胰腺癌细胞的侵袭能力。本研究发现，EGF可以上调NF-κB的表达，应用厄洛替尼处理后的胰腺癌PANC-1细胞增殖明显受到抑制，并且能够明显下调NF-κB活性。提示厄洛替尼可通过抑制EFG介导的NF-κB的活化，发挥其抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的作用。

综上所述，厄洛替尼可通过抑制 NF-κB的表达，抑制胰腺癌细胞的侵袭力，可以用做胰腺癌的一线治疗。本实验从分子水平为其抗肿瘤浸润提供了实验依据。

［1］Kim MA，Lee HS，Lee HE，et al.EGFR in gastric carcinomas:prognostic significance of protein overexpression and high gene copy number［J］.Histopathology，2008，52(6):738-746.

［2］Tang ZY，Wu YL，Cao SL，et al.Effect of the proteasome inhibitor bortemmib on gene expression profiles of pancreatic cancer cells［J］.J Surg Res，2008，145(1):111-123.

［3］张圣林，刘春丽，王淑萍，等.厄洛替尼联合放疗对MKN45细胞株的影响［J］.世界华人消化杂志，2012，20(17):1502-1508.

［4］Beger HG，Rau B，Gansauge F.Treatment of pancreatic cancer:challenge of the facts［J］.World J Surg，2003，27(10):1075-1084.

［5］郑树森，黄东胜，孥启勇，等.胰腺癌的早期诊断是提高疗效的关键［J］.中华外科杂志，2003，41(5):322-323.

［6］张浩，刘晓芳，刘昱翼，等.EFG介导的NF-κB促进体外胰腺癌细胞的uPA表达与侵袭力［J］.中华肿瘤杂志，2007，12(29):909-912.

［7］Vaira V，Lee CW，Goel HL，et al.Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling［J］.J Onco Gene，2007，26(19):2678-2684.

［8］Laurence J，Murat T.NF-κB signaling pros and cons of the ring NF-κB as a therapeutic approach［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1072(8):114-122.

［9］刘红波，杨安，张贵堂.NF-κB与COX-2在胃癌及转移淋巴结中的表达研究［J］.现代肿瘤医学，2010，18(12):2429-2431.

［10］Min C，Eddy SF，Sherr DH，et al.NF-kappa B and epithelial to esenchymal transition of cancer［J］.J Cell Biochem，2008，104(3):733.

［11］Wang Z，Banerjee S，Li Y，et al.Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-κB，vascular endothelial growth factor，and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66(15):2778-2784.

［12］程卓，鑫孙备，王双佳，等.核因子κB在缺氧微环境中对胰腺癌细胞上皮一间质转化调控作用的实验研究［J］.中华外科杂志，2012，5(50):446-451.

［13］张浩，刘晓芳，刘昱翼，等.EFG介导的NF-κB促进体外胰腺癌细胞的uPA表达与侵袭力［J］.中华肿瘤杂志，2007，12(29):909-912.