厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549增殖的影响

谷 蕾，吕喜英

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院放化疗科）

厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549增殖的影响

谷 蕾1，吕喜英2△

（1.承德医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院放化疗科）

目的:探讨厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549的作用。方法:survivin siRNA转染、厄洛替尼单独或联合应用于人肺腺癌细胞A549，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT）比色法观察对A549细胞的增殖抑制作用，免疫组化染色法观察A549细胞Survivin蛋白的表达情况。结果:survivin siRNA转染联合厄洛替尼对A549细胞具有明显的抑制作用，且可明显降低A549细胞Survivin蛋白的表达，与单独应用survivin siRNA转染和厄洛替尼比较均有统计学意义(P＜0.01）。结论:应用siRNA沉默survivin表达可提高人肺腺癌细胞A549对厄洛替尼的敏感性。

厄洛替尼；survivin siRNA；人肺腺癌A549细胞

Survivin表达于包括肺癌在内的几乎所有恶性肿瘤组织中。厄洛替尼(Erlotinib)为口服的I型人表皮生长因子受体(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI），用于化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌(NSCLC）的二线治疗。本研究观察了厄洛替尼联合survivin siRNA对人肺腺癌细胞A549的增殖抑制作用，探讨二者联合应用是否具有协同效应，以及survivin siRNA是否增强厄洛替尼的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料 p53野生型肺癌细胞株A549，河北医科大学第四附属医院；靶向survivin的 siRNA、siRNA转染试剂、siRNA转染培养基、鼠抗人Survivin蛋白单克隆抗体、β-actin一抗及羊抗鼠二抗，Santa Cruz公司；MTT，上海华舜生物工程有限公司；二甲基亚砜(DMSO），成都天泰公司；二步法免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；厄洛替尼，上海罗氏制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：A549细胞接种于50ml培养瓶，用含10%新生牛血清的RPMI l640培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 survivin siRNA转染(以6孔板为例）：转染前1天用0.25%的胰酶消化细胞，将A549细胞以2×105/孔接种于6孔板，至细胞融合约60%-80%时进行转染，分别用survivin siRNA及阴性对照siRNA-A转染A549细胞(survivin siRNA与siRNA转染试剂比例为1：1.2）。

1.2.3 实验分组：实验分为5组：空白对照组，siRNAA转染对照组，survivin siRNA转染组，厄洛替尼处理组，survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组。空白对照组和厄洛替尼处理组细胞用含10%新生牛血清的RPMI l640培养液培养，不进行转染，其中厄洛替尼处理组细胞加入厄洛替尼，终浓度为12.5μmol/L。siRNA-A转染对照组，survivin siRNA转染组，survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组细胞进行转染，转染6h后换为含l0%新生牛血清RPMI l640培养液，其中survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组加入厄洛替尼，终浓度为12.5μmol/ L。

1.2.4 MTT比色法检测细胞增殖：调整A549细胞浓度，以3×103/孔接种于96孔培养板，每组设6个复孔。转染、加药处理，48h后各组弃培养液，每孔加入MTT(5mg/ ml)20μl，37℃孵育4h，轻轻吸弃培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min。于490nm波长处采用酶联免疫检测仪测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞抑制率。抑制率=[(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值]×100%。

1.2.5 免疫组化染色观察Survivin蛋白表达的变化：细胞爬片后经转染、加药处理，培养48h后，采用二步法免疫组化染色方法观察A549细胞Survivin蛋白的表达，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。以胞浆和(或）细胞核出现棕黄色颗粒为染色阳性。免疫组化染色结果根据阳性细胞百分比及着色强度进行综合分析：①阳性细胞百分比：随机选取5个高倍镜视野(×400），计数100个细胞中的阳性细胞数并计分，0分(＜5%）、l分(5%-25%）、2分（25%-50%）、3分(50%-75%）、4分(＞75%）。②着色程度：不着色为0分，淡黄色(弱阳性）为1分，黄色或深黄色(中等阳性）为2分，褐色或棕褐色(强阳性）为3分。以阳性细胞率和染色强度分值的乘积作为每一例的积分，以积分作为Survivin蛋白的相对表达水平[1]。

2 结果

2.1 MTT法染色结果 siRNA-A转染对照组细胞增殖未受到明显抑制。与siRNA-A转染对照组相比，survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组及survivin siRNA+厄洛替尼处理组A549细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01）；与survivin siRNA转染组和厄洛替尼处理组比较，survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组细胞的抑制率明显升高(P＜0.01）。2×2析因设计的方差分析显示，survivin siRNA转染和厄洛替尼处理两种因素存在交互作用(F=44.105，P＜0.01），表现为协同作用。见附表。

附表 MTT法和免疫组化染色结果(±s）

附表 MTT法和免疫组化染色结果(±s）

与siRNA-A转染对照组比较:*P＜0.01，与survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组比较:#P＜0.01

组别 抑制率(%) Survivin蛋白空白对照组 --- 8.85±0.67 siRNA-A转染对照组 0.85±8.24 8.70±0.92厄洛替尼处理组 60.28±3.23*# 3.80±0.62*#survivin siRNA转染组 47.68±4.09*# 3.40±0.94*#survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组 78.14±4.34* 1.15±0.37*

2.2 A549细胞Survivin蛋白的表达 Surviving蛋白免疫阳性产物位于A549细胞的细胞质和细胞核，空白对照组及siRNA-A转染对照组可见大量阳性细胞，survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组及survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组阳性细胞较少(附图）。Survivin蛋白定量分析结果见附表：survivin siRNA转染组、厄洛替尼处理组及survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组Survivin蛋白的表达明显低于空白对照组及siRNA-A转染对照组(P＜0.01），且survivin siRNA转染+厄洛替尼处理组明显低于survivin siRNA转染组和厄洛替尼处理组(P＜0.01）。

附图 A549细胞Survivin蛋白的表达(×400)

3 讨论

厄洛替尼对肺癌患者相关症状具有良好的改善作用，咳嗽、呼吸困难与疼痛的改善率分别可达44%、34%和30%[2]。厄洛替尼不良反应发生率较低，病人耐受性好，对于老年、一般情况较差的晚期NSCLC患者仍是安全有效的选择。但由于几乎所有的患者最后都会产生耐药，限制了其长期疗效。厄洛替尼联合标准含铂一线化疗方案不能额外改善生存率，因此迫切需要寻找能增强厄洛替尼抗肿瘤作用的方法[3]。逃避凋亡是肿瘤发生、发展和药物抵抗的重要机制[4]。大量研究表明，survivin高表达的肿瘤细胞可耐受化疗、放疗，下调survivin的表达可增加肿瘤细胞化疗、放疗时的凋亡[5]。Falleni等[6]的研究显示了survivin基因在肺癌早期诊断中的价值，也是“基因沉默”治疗比较理想的靶点[7]。有研究表明，在哺乳类、人类细胞中直接导入人工合成的siRNA，一方面可避免激活干扰素途径，另一方面可使相应序列的靶向基因mRNA产生明显的特异性抑制效应[8]。据此机制，依照靶基因mRNA设计序列特异性siRNA，可起到封闭特异性基因表达的作用。

本研究通过survivin siRNA沉默survivin的表达，并联合应用厄洛替尼，发现survivin siRNA转染和厄洛替尼联用对A549细胞的增殖抑制作用明显增强，并能显著降低A549细胞Survivin蛋白的表达水平，明显优于单独应用厄洛替尼。因此表明，survivin siRNA转染和厄洛替尼处理两种因素具有协同作用，但作用机制有待于进一步研究。本研究证明，转染survivin siRNA沉默survivin的表达可增强厄洛替尼对A549细胞的增殖抑制作用，降低Survivin蛋白的表达水平，从而增强厄洛替尼的抗肿瘤作用。本研究为提高厄洛替尼对NSCLC的治疗效果提供了新的治疗思路和实验依据。

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[6]Falleni M,Pellegrini C,Marchetti A,et a1.Survivin gene expression in early-stage non-small cell lung cancer[J].J Pathol,2003,200(5):620-626.

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EFFECTS OF ERLOTINIB COMBINED SURVIVIN SIRNA ON PROLIFERATION OF HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549

GU Lei, LV Xi-ying
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of erlotinib combined survivin siRNA on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:The lung adenocarcinoma cell line A549 was treated with survivin siRNA transfection and erlotinib alone or in combination. MTT method was used to observe the inhibitory effects of proliferation on A549 cells, and immunohistochemical staining to observe expression of Survivin protein in A549 cells.Results:Erlotinib combined survivin siRNA had obvious inhibitory effects on A549 cells, and could obviously decreased expression of Survivin protein in A549 cells. There had obvious differences between erlotinib combined survivin siRNA and erlotinib or survivin siRNA alone (P＜0.01).Conclusions:Survivin siRNA silence the expression of survivin can enhance sensitivity of human lung adenocarcinoma cancer cell line A549 to erlotinib.

Erlotinib; Survivin siRNA; A549 cells

R734.2

A

1004-6879(2011）02-0122-03

2010-12-20）

△ 通讯作者