大鼠海马神经元癫痫样放电模型的构建

董长征 赵文清 李文玲 岳向勇 孔艳莉 康进生 梁传栋 王蕴欣

大鼠海马神经元癫痫样放电模型的构建

董长征 赵文清 李文玲 岳向勇 孔艳莉 康进生 梁传栋 王蕴欣

目的探讨“无镁细胞外液”诱导体外培养大鼠海马神经元产生癫痫样放电的可行性，以期建立难治性癫痫离体细胞模型。方法选取24 h内新生Wistar大鼠，分离海马神经元后进行原代培养，体外培养至第12天时，用“无镁细胞外液”处理3 h，应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元的放电情况。结果在培养第12天时，神经元突起间彼此接触形成神经网络。在“无镁细胞外液”处理3 h后神经元产生稳定的放电，恢复正常细胞培养液培养24 h，神经元仍可检测到自发的“癫痫样放电”。结论体外培养第12天海马神经元，在“无镁细胞外液”处理后可形成稳定的自发性癫痫样放电，为今后在细胞分子水平研究癫痫发病机制提供了一种理想模型。

海马;神经元;膜片钳;癫痫样放电;动作电位;原代培养

药物难治性癫痫是神经科常见病之一，其发病机制目前尚不十分清楚，既往研究多来源于完整脑组织切片，遗传模型以及培养神经元模型，每一种癫痫模型都有其自身的优势和不足;除非使用药物或电刺激，否则很难形成一个反复自发性癫痫模型［1］。体外培养的单纯神经元环路被认为适合用于进行复杂生物物理以及药理遗传学的研究来理解病理状态下癫痫的传播和维持。然而，尽管已经有能力在培养的微小神经元上诱发出药理学意义上的癫痫样活动［2］，但在培养神经元中产生持久的自发性反复性癫痫发作尚困难重重。本研究拟将体外培养第12天的大鼠海马神经元，用“无镁细胞外液”处理3 h，用全细胞膜片钳技术检测神经元动作电位的变化，建立海马神经元癫痫样放电模型，为进一步研究癫痫发病机制以及神经肽Y药物干预提供理想的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生24 h内Wistar大鼠20只，由英国利兹大学生物系实验动物中心提供。饲养环境温度20～23℃，湿度45% ～50%，清洁级。

1.2 主要试剂 Neurobasal TM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、L-多聚赖氨酸、B27、D-Hanks液、胰蛋白酶为GIBCO公司制品;氯化镁(MgCl2·6H2O)分析纯为英国Fisher Scientific公司;正常细胞外液组成成分(mmol/L):NaCl 147，HEPES 10，Glucose 13，KCl2，CaCl2，MgC12;用 5 mmol/L NaOH 调节 pH 值至7.3，调整渗透压为280～320 mmol/L。无镁细胞外液组成成分(mmol/L):NaCl 147，HEPES 10，Glucose 13，KCl 2，CaCl22;用5 mmol/L Na0H调节pH值至7.3，调整渗透压为280～320 mmol/L。

1.3 主要仪器设备 膜片钳放大器(Axon 200B)，模/数转换器(Digidata 1320A 16-bit Aequisition System)，灌流控制系统(BPS-8)，CO2培养箱(Heraeus240)，倒置相差显微镜(Olympus1 CK2)，微电极拉制仪(Model P-97)，微电极抛光仪(2002-C)，一次性细胞塑料培养皿、培养瓶(Costra)，AG135电子天平(Mettler Toled)。

1.4 方法

1.4.1 原代海马神经元的分离、种植与培养:新生24 h Wistar大鼠，75%酒精消毒，断头取脑，移至盛有冷的事先配好的1×解剖液的培养皿中。在解剖显微镜辅助下，去除脑组织表面的血管和软脑膜，分离双侧大鼠海马组织。将分离好的月牙形状的海马组织放进盛有解剖液的1.5 ml eppendorf管中，移至细胞超净台。把500 μl 0.25%的胰蛋白酶-EDTA加到盛有500 μl的1×解剖液的eppendorf管中配置成2×解剖液备用;吸出盛有海马标本的eppendorf管中的1×解剖液，加入配好的1 ml 2×解剖液，37℃ CO2培养箱中消化15 min。吸出消化液，加入1 ml NM5培养基，中和胰酶，轻轻摇晃均匀;再次吸出NM5培养基，再次摇匀，再次吸掉NM5培养基，加入1 ml NM5培养基，用手动单道可调式移液器轻轻吹打组织块15次(不超过20次)，制作成单细胞悬液。静置3～5 min。向预先用0.1 mg/ml多聚赖氨酸过夜处理过的35 mm细胞培养皿中加入1.5 ml NM5培养基，每个培养皿中预先放入4个载玻片。吸出含有海马神经元的上清液，勿吸入管底的细胞残渣，用计数板进行细胞计数，用细胞培养液将细胞数调整为(2～5)×105cells/ml，然后将细胞分别接种于细胞培养皿中。将细胞放入5%CO2，37℃，95%湿度的CO2培养箱中进行培养，2～3 h后用NM5培养基全量换液;3 d后，用NM5培养基半量换液;自第6天起，用加入10 μmol/L阿糖胞苷(Ara-C)NM1培养基半量换液。每天在倒置相差显微镜下观察神经元生长状况，包括细胞突起、形态、轮廓及细胞密度等。培养第12天的细胞用于后续膜片钳试验。

1.4.2 膜片钳记录海马神经元动作电位变化:将体外培养至第12天的海马神经元分为2组:正常细胞外液组，无镁细胞外液处理组。后者，在神经元换液后，改无镁细胞外液培养3 h，恢复原维持液培养，然后，应用膜片钳系统进行全细胞模式的电流钳记录。分别检测2组神经元动作电位情况。设定参数:记录模式为CClamp，C-fast 7.86 pF，C-Slow 50.00 pF，Amplitude 5.0 mV，length 5.0 ms，Gain 2 mV/PA。

2 结果

2.1 海马神经元的形态学检测 分离的海马神经元培养12 h后大部分贴壁，24 h后细胞形态多样，突起明显增多。48 h后细胞突起不断延长。培养第6天后，可见锥体形状的神经元，有立体感，细胞核呈空泡状，核仁清晰。培养第12天后，细胞周围有光晕，胞体略突出饱满、折光性良好，细胞突起长，细胞之间形成广泛的突触联系，典型的神经网状结构形成。16～18 d后神经元突起断裂，部分细胞开始裂解。选取小形态一致的多角形，胞体饱满，周围带光晕发育良好神经元用于后续膜片钳试验。见图1。

2.2 海马神经元癫痫样放电的记录 体外培养正常海马神经元可见自发性兴奋性突触后电位，偶有动作电位发放;无镁细胞外液处理神经元3 h后，可检测到频发的动作电位发放，频率15～25个/s，波幅70～98 mV。改用正常培养基培养24 h，仍可检测到较多的高波幅的异常放电，说明无镁细胞外液处理神经元3 h，可以形成稳定的反复自发性癫痫样放电模型，可以很好模拟人体内神经元癫痫样放电状态。见图2～4。

图1 原代培养第12天海马神经元形态

图2 正常海马神经元偶有动作电位发放

图3 无镁细胞外液处理神经元3 h频繁动作电位发放

图4 无镁细胞外液处理神经元24 h较多的动作电位发放

3 讨论

近年来，对大多数的有关癫痫的机制研究多采用临床手术标本以及各种化学药物或物理方法诱导的各种急慢性癫痫模型［3］，为了从细胞水平研究癫痫的发病机制，构建一个能模拟人体内神经元放电的模型非常必要。

Mg2+在维持中枢神经系统正常电生理活动和神经元的突触联系中起着重要作用［4］。镁离子在某些癫痫动物模型中显示具有抑制癫痫发作和神经保护作用，表现在下列几方面:抑制Caspase-3的表达，减少神经元凋亡;非竞争性阻断NMDA受体，减少神经毒性作用;能竞争磷脂离子连接位点起到抗氧自由基作用，抑制了脂质过氧化。因此，移除细胞生存环境的镁离子，可以诱发神经元的高兴奋性状态，模拟神经元异常放电［5］。Sombati等［6］研究提示无镁诱发的神经元出现自发性反复性发放的动作电位与临床癫痫发作时的电生理活动极为类似，抗癫痫药物如苯妥英钠能抑制这类动作电位的发生。本部分研究根据上述镁离子的生理特性，移除细胞外液镁离子来模拟“癫痫微环境”，诱导原代培养海马神经元癫痫样放电。结果显示经无镁细胞外液处理3 h后，100%神经元出现频发的高波幅动作电位发放。与处理前相比，动作电位的幅度和频率明显增高和增多;换用正常细胞外液培养后24 h，监测90%以上的神经元仍然存在反复自发性癫痫样放电，有利的证实了此癫痫神经元放电模型的稳定可靠性。试验中我们发现培养的海马神经元经无镁细胞外液处理后易激惹，细胞活性较正常弱，但仍可进行膜片钳记录电活动，无镁细胞外液处理5 h后的神经元活性较前减弱，较难用于膜片钳封接，鉴于此，我们认为无镁细胞外液处理3 h时的神经元最适合用来研究癫痫的细胞分子水平的电生理研究。

我们利用原代培养第12天的海马神经元进行电生理研究，因为此时，培养的海马神经元贴壁后形成许多突起，并且彼此之间形成了复杂的神经网络，表明我们培养的海马神经元在体外仍能形成广泛的突触联系，具备突触间生物信息传递的形态学基础，能很好模拟在体神经元的生理状态。这与既往文献报道相吻合［7］。我们先前研究已经通过动物实验观察了神经肽Y对癫痫大鼠发作的影响［8］;海马神经元癫痫样放电模型的成功建立，为我们下一步在细胞分子学水平上研究神经肽Y对癫痫神经元兴奋性的影响打下坚实基础。

1 Wong M.Epilepsy in a Dish:An In Vitro Model of Epileptogenesis.Epilepsy Curr，2011，11:153-154.

2 Keller CJ，Truccolo W，Gale JT，et al.Heterogeneous neuronal firing patterns during interictal epileptiform discharges in the human cortex.Brain，2010，133:1668-1681.

3 Raol YH，Brooks-Kayal AR.Experimental models of seizures and epilepsies.Prog Mol Biol Transl Sci，2012，105:57-82.

4 Igelstrm KM，Shirley CH，Heyward PM.Low-magnesium medium induces epileptiform activity in mouse olfactory bulb slices.J Neurophysiol，2011，106:2593-2605.

5 Tancredi V，Hwa GG，Zona C，et al.Low magnesium epileptogenesis in the rat hippocampal slice:electrophysiological and pharmacological features.Brain Res，1990，511:280-290.

6 Sombati S，DeLorenzo RJ.Recurrent spontaneous seizure activity in hippocampal neuronal networks in culture.J Neurophysiol，1995，73:1706-1711.

7 Molnár E.Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.Semin Cell Dev Biol，2011，22:506-513.

8 董长征，赵文清，李文玲，等.重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠行为及脑电图的影响.第三军医大学学报，2010，32:2140-2142.

Establishment of the epileptiform discharge model in rat hippocampal neuron

DONG Changzheng，ZHAO Wenqing，LI Wenling，et al.Department of Functional Neurosurgery，，Hebei Procincial People＇s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo explore the feasibility of epileptiform discharge of rat hippocampal neurons cultured in vitro and induced by magnesium-free extracellular fluid in order to establish refractory epilepsy model in cultured cells.MethodsThe neonatal Wistar rats within 24h were used to isolate hippocampal neuron to carry out primary culture in vitro.After 12d，the hippocampal neurons were treated with magnesium free extracellular fluid for 3h，then neuronal discharge activities were recorded by whole cell patch clamping technique.ResultsAfter 12 － day cell culture，neuronal dendrites touched each other to form neural network.After 3 － hour treatment by magnesium-free extracellular fluid，the neurons produced stable discharge，however，after 24 － hour treatment with normal cell culture fluid，the spontaneous epileptiform activity in neurons could still be observed.ConclusionThe stable spontaneous epileptiform activity can be formed in hippocanlpal neurons cultured in vitro for 12d，after exposed in magnesium free extracellular fluid for 3h，which provides an ideal model for pathogenetic research about epilepsy at cell and molecular level.

hippocampus;neurons;whole-cell patch-clamp technique;epileptiform discharges;action potential;primary culture

R 338

A

1002－7386(2014)14－2093－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.14.004

050051 石家庄市，河北省人民医院功能神经外科(董长征、赵文清、李文玲、岳向勇、孔艳莉、康进生、梁传栋)，麻醉科(王蕴欣)

李文玲，050051 河北省人民医院功能神经外科;E-mail:liwelling@163.com

2014－01－11)