瞬时外向钾电流在糖尿病心肌病电重构中的作用

刘星+张良胜+诸波+査克岚+张雪梅+杨悠+范忠才

[摘要] 目的 探讨糖尿病心肌病（DCM）大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）的变化，了解其在电重构中的作用。方法 选用20只健康成年SD大鼠，随机分为对照组（n=10）和DCM组（n=10），并通过病理组织学证实为DCM心肌病理学改变。分别对两组大鼠采用改进的耐钙成年大鼠急性酶分离方法分离心肌细胞，运用膜片钳技术以全细胞模式分别记录两组大鼠心室肌单细胞的Ito和膜电容，并分析比较两组大鼠心室肌Ito的变化。 结果 与对照组比较，DCM组大鼠左心室心肌细胞的Ito电流密度显著低于对照组[+70 mV时，（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF]（P<0.05），DCM组的Ito的I-V曲线明显较对照组下移。 结论 DCM的Ito数量明显减少，在DCM心肌电重构中起着重要作用。Ito的减少及Ito通道的分布密度不同，可导致动作电位时程与有效不应期发生变化，可能与临床严重心律失常的发生有关。

[关键词] 糖尿病心肌病；电重构；膜片钳；瞬时外向钾电流

[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（a）-0004-05

Effect of transient outward potassium current on ventricular electrophysiological remodeling in diabetic cardiomyopathy

LIU Xing1 ZHANG Liang-sheng2 ZHU Bo1 ZHA Ke-lan1 ZHANG Xue-mei1 YANG You1 FAN Zhon-cai1▲

1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China；2.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongcheng City in Henan Province，Yongcheng 476600，China

[Abstract] Objective To investigate the changes of the transient outward potassium current （Ito） on ventricular myocardium in diabetic cardiomyopathy （DCM） rat and to explore the meaning of theses changes for ventricular electrophysiological remodeling. Methods 20 healthy adult Spprague-dawley rats were selected and randomly divided into control group （n=10） and DCM group （n=10）.The myocardial pathological alterations of DCM were identified in DCM group by histopathologic test，and cardiomyocytes in both groups were separated by advanced calcium-tolerant separation method.Whole-cell path clamp technique was used to record the unicellular changes of Ito and membrane capacitance in left ventricular myocytes for DCM and control group respectively.All data were analysed and compaired by software. Results Compared with control group，the Ito density on left ventricular myocytes was significantly lower in DCM group than that of the control group [（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF，at +70 mV]（P<0.05），and the I-V curve of Ito in DCM group was more depressed than the control group markedly. Conclusion The changes of Ito play an important role in cardiac electrophysiological remodeling of diabetic cardiomyopathy.The reduction of Ito and the variations of Ito density may be lead to the modifications of action potential duration and effective refractory period，which associates with severe arrthymia.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy；Electrophysiological remodeling；Pacth clamp；Transient outward potassium current

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指由糖尿病引起的心脏微血管病变、心肌代谢紊乱和心肌纤维化，最终引起心室肥厚、舒张期和（或）收缩期功能障碍的一种疾病状态[1]。DCM是一种特异性心肌病，发病率高且其潜在患者数量庞大，极易导致心力衰竭和严重心律失常。临床研究发现，DCM严重心律失常的发生率非常高，其一旦发生不仅恶化心功能，加重心肌损伤，而且极易导致患者死亡。目前多数学者认为DCM恶性心律失常的发生与心室肌离子流及其通道改变即电重构现象有关。瞬时外向钾电流（Ito）是心肌细胞上发现较早的离子流，对于心肌细胞1期复极及平台期形成有重要影响；同时Ito在心内、外膜心肌上的正常分布密度可维持其正常的动作电位时程（active potential duration，APD）离散度，从而起到维持心肌电稳定的作用。一旦Ito发生结构和功能以及分布的紊乱极易导致心肌的电学改变，临床上可表现为心律失常。本研究通过链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射建立大鼠DCM模型，利用膜片钳技术检测心室肌细胞Ito的变化，以明确Ito电流在DCM心室电重构中的变化情况，从而了解其在电重构中的作用，有助于阐明DCM心室电重构的发生机制及其与心律失常的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD成年大鼠20只，清洁级，雌雄不拘，体重180～220 g，购于第三军医大学医学实验动物中心。实验中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.2 试剂与主要仪器

1.2.1 主要试剂 胶原酶Ⅱ，血清白蛋白，牛磺酸，乙二醇双四乙酸（EGTA），羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），谷氨酸，氯化钴，STZ，天冬氨酸钾。均为Sigma公司产品。

1.2.2 主要仪器 膜片钳放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）；A/D转换器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）；倒置相差显微镜（Axivert-135，Zeiss，Germany）；三维操纵器（WN 203，Narishige，Japan）；电极经横式拉制机（P-97 sutter，USA）；体视显微镜（S8APO，LEICA，Germany）；Langendorff灌流装置（ML176，Austrilia）等。

1.3 实验方法

1.3.1 DCM大鼠造模 将20只SD大鼠随机分为对照组（n=10）和DCM组（n=10），对照组始终以普通饲料喂养，DCM组以高脂饮食喂养（20%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉，0.5%胆固醇和59.5%基础饲料）。喂养至第6周DCM组以1%STZ 30 mg/kg腹腔注射，对照组以同体积枸橼酸缓冲液一次性腹腔注射。72 h后尾静脉取血测空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L判断为2型糖尿病造模结束。对照组普通饲料喂养6周，DCM组高脂高糖饲料喂养6周[1-2]。

1.3.2 分离心肌细胞 将无钙台氏液、KB液和酶液分别用95%O2和5%CO2饱和30 min，打开与Langendorff相连的恒温浴槽相连，检测温度为37℃。用去离子水冲洗Langendorff系统10 min。用3%戊巴比妥钠0.2 ml/100 g，肝素4 U/g对SD大鼠腹腔注射。麻醉成功后，剪开大鼠胸腔，迅速取出心脏后置于4℃无钙台氏液中，轻轻挤压心脏排出残血，经主动脉逆行插管，固定于Langendorff灌流装置上。先用无钙台氏液冲净残存在冠状动脉和心室中的血液，换成消化酶液以8 ml/min持续灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小块左心室组织，共10次，依次装于盛有KB液的10个小瓶中。将取下的心肌组织块剪碎，用吸管轻轻吹打，再用200目筛网过滤，得到细胞混悬液，置于氧饱和的KB液保存，室温下1 h后置于4℃冰箱中备用[3]。

1.3.3 全细胞膜片钳记录Ito 取急性酶分离的大鼠心肌细胞，采用全细胞膜片钳记录模式记录电流。选择细胞膜光滑完整、横纹清楚、无收缩的细胞，制作形成细胞贴附式膜片（cell-attached patch），在此基础上，向微电极内给予较强的负压形成全细胞记录构型。最后施以Ito电流刺激方案，引导出Ito电流刺激波形。本实验使用膜片钳放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）记录电流信号，经A/D转换器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）处理后，用Clampex（version 10.1）软件系统采集后储存于计算机中。采样频率为10 kHz，采样方式为Clampex下的Episodic stimulation[4-5]。

1.4 统计学处理

采用Originpro 8.0对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞的细胞活性

镜下可见两种细胞：一种为死亡细胞，细胞挛缩，呈圆形或者椭圆形，横纹消失，细胞溶解，细胞膜破裂；另一种细胞为存活心肌，呈杆状或矩形，横纹清晰，表面干净，折光性好，立体感强（图1箭头）。

图1 分离的心室肌细胞（箭头所指）

2.2 病理切片观察结果

随机抽取对照组及DCM组各两只大鼠作病理切片检查，结果对照组心肌纤维排列整齐，可见横纹，胞质丰富，细胞间隙正常（图2）。DCM组心肌细胞呈空泡状，排列紊乱、扭曲，部分心肌纤维断裂、坏死，坏死心肌由纤维组织替代，符合DCM心肌病理变化（图3）。

图2 对照组左室心肌细胞HE染色（×400）

图3 DCM组左室心肌细胞HE染色（×400）

2.3 心室肌细胞Ito的变化

保持电位于-80 mV下，以10 mV为阶跃，自-50 mV除极至+70 mV，钳制时间为300 ms引出Ito（图4～图6）。通过记录将Ito的电流强度、膜电容、电流密度进行分析。

图4 DCM组左心室肌细胞Ito

图5 对照组左心室肌细胞Ito

图6 Ito的刺激方案

2.3.1 膜电容 DCM组心室肌膜电容为（59.92±15.96） pF，对照组的膜电容为（58.75±16.41） pF，两组差异无统计学意义（P>0.05）（图7）。

图7 DCM组与对照组左心室肌细胞膜电容

2.3.2 电流密度 -40～-20 mV，DCM组Ito密度略高于对照组（P>0.05）；在钳制电位-10～+70 mV，DCM组Ito密度低于对照组（P<0.05），且随钳制电位增加差异性越显著，当指令电压达到+70 mV时，DCM组电流密度为（16.80±9.10） pA/pF，而对照组达（36.25±5.20） pA/pF，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 DCM组与对照组大鼠心肌细胞Ito的电流密度（pA/pF，x±s）

与对照组比较，*P<0.05

2.3.3 I-V曲线 DCM组和对照组的I-V曲线均呈线性依赖性，为内向整流特性，指令电压-50～-20 mV，电流幅度增加不明显，两组曲线走向平缓。指令电压 -20～+70 mV，对照组电流增幅较大，而DCM组增幅较小，DCM组明显较对照组下移，尤其是在指令电压 +10 mV以后更为明显（图8）。

图8 对照组与DCM组心室肌细胞Ito的I-V曲线

3 讨论

1974年Hamby等首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起心脏微血管病变、肌代谢紊乱和心肌纤维化等所致的心肌广泛结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和（或）收缩期功能障碍的一种疾病状态[6]。糖尿病及其并发的DCM容易导致心力衰竭和多种心律失常。大量研究显示，糖尿病是心房颤动的独立高危因子[7-8]；糖尿病患者极易发生室性心律失常及猝死[9-10]，严重威胁着人类的生命健康。然而目前对这类受损心肌发生心律失常的机制尚不甚清楚。以往大量的研究已经证实心律失常的发生与细胞内外离子流以及相关离子通道的变化即电重构密切相关。因此，明确DCM心肌细胞是否存在电重构，以及相关的离子及通道发生了怎样的改变意义重大，有助于阐明DCM发生心律失常的电生理机制。

在心肌细胞，钾离子（K+）直接参与心肌电兴奋的恢复过程，对APD的长短具有决定性作用，故K+浓度及K+通道的变化是导致严重心律失常的重要因素之一。细胞内K+浓度的变化主要依赖于细胞内的K+外流，其中Ito在APD 0相时被激活并参与了APD 1相复极过程。Ito是心肌细胞上发现较早的离子流，包含两种成分：Ito1与Ito2。它们的发生机制不同，Ito1是对4-APD敏感的（SH族），后者是Ca2+依赖性的（SLO族），但在分子结构上均由4个α螺旋亚单位构成。Ito2情况复杂，研究较少，一般Ito均指Ito1。Ito1对2相APD的起始水平起决定性作用，调节L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交换的活性，影响APD[11]。在大鼠和人类心肌细胞上Ito电流很强，电生理特性相似[12]。在大鼠和人类心室肌记录到动作电位1期的切迹是由Ito引起的，Ito对于1期复极及平台期形成有重要影响。若Ito很强，APD呈三角形，APD缩短；反之Ito减弱，平台期延长，APD延长。有报道认为Ito减弱，使心室复极延长，可引发各种心律失常[13]。Ito不同的分布密度比例会使心外膜与心内膜APD不同，从而使心脏APD离散度增加，引起各向异质性，导致折返性心律失常。Ito相关的钾通道主要有KV1.4、KV4.2和KV4.3，在不同的哺乳动物，三种通道分布不同[14]。在人类KV4.3对Ito形成起主要作用[15]，KV1.4有少量表达。有研究表明，心力衰竭时KV4.3在心肌的表达量明显下降，而KV1.4表达则上升，并在不同的部位上升的幅度不同，这可能对心室肌Ito分布密度梯度的形成有主要作用[16]。因此，研究Ito在电重构中的作用有重要意义。

本课题通过对两组大鼠心肌细胞Ito的记录及分析显示，在电压为+70 mV时，DCM组的电流密度较对照组明显降低（P<0.05），从I-V曲线看，DCM组较对照组下移明显。该结果证实了在DCM心室肌细胞存在Ito的明显变化，这可能是导致其心室电重构的重要离子变化，产生这种结果的原因可能是：①DCM心室肌细胞Ito开放数目减少或通道开放受抑制；②DCM心肌细胞广泛水肿，导致细胞膜电容增大，Ito电流相对减小。根据本实验结果及其他学者相关研究，认为在DCM的电重构可能表现如下：①在DCM发病过程中，心室肌细胞Ito减小，引起1相复极速度减慢，平台期延长，有效不应期和APD延长，整个复极时间延长，发生后除极，发生心律失常；②Ito不同的分布密度比例，心内膜与心外膜APD不同，动作电位离散度增加，引起各向异质性，形成折返，在临床上表现为各种心律失常，如室性心动过速、心室颤动等。

综上所述，DCM心肌细胞存在电重构，Ito在其中扮演着重要角色，进一步充分深入研究该离子通道的改变及相关影响因素，将有助于阐明DCM电重构的发生发展机制及其与心律失常的关系，从而为不久的将来临床防治DCM心律失常提供新的方法奠定理论基础。

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（收稿日期：2014-07-15 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期：2014-07-15 本文编辑：郭静娟）

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（收稿日期：2014-07-15 本文编辑：郭静娟）