响应曲面法优化柠檬皮渣苦素提取工艺

李建凤，廖立敏，2*

1内江师范学院 化学化工学院;2 四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，内江 641112

柑橘类水果为我国第三大国际贸易农产品，四川是我国柑橘类水果的主要产地之一，盛产柠檬、柑橘、塔罗科血橙和脐橙等柑橘类水果。内江地区是四川柑橘类水果的主要生产基地之一，四川安岳，早在二三十年代就开始种植柠檬，被誉为“中国柠檬之乡”。内江现有柠檬种植面积13 万亩，其附近的安岳现有柠檬种植面积23 万亩，总产值近18 亿元。内江现有饮料制造企业近50 家，内江及安岳年加工柑橘类鲜果100 余万吨。而柑橘类果皮渣是柑橘类水果加工业的主要副产物，约占整个果重的25%～40%，因此内江及安岳每年产生约25～40 余万吨的柑橘类果皮渣废弃物。传统的处理方法是将其直接进行丢弃、填埋或小部分加工成饲料，从环境和经济的角度分析，都是不科学、不合理的解决途径，造成了极大的浪费，给当地环境带来了负面影响。因此柑橘果皮的综合利用对提高柑橘加工厂的经济效益和减少污染、保护环境都是十分有利的。

柠檬皮渣中含有丰富的果胶［1］、黄酮［2］、柠檬苦素等活性物质，对其合理利用具有较好的经济效益和环境效益。柠檬苦素类化合物是一类三萜类物质，研究表明其具有明显的抗菌［3］、抗癌［4］和昆虫不育［5］等作用。目前对苦素类物质的提取分离方法主要有水抽提法［6］、有机溶剂提取法［7］、超临界CO2萃取法［8］、超声提取法［9］和离子交换法［10］等。本实验以乙醇为提取溶剂，采用超声波提取柠檬皮渣中的苦素类物质，并运用响应曲面法优化工艺条件，以期提高柠檬皮渣中苦素的得率，为开发柑橘类果皮渣中的苦素类物质提供有益参考。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

UVmini-1240 紫外可外分光光度计(日本岛津公司);KQ-400KDB 型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);CP2202S 电子分析天枰(赛特利斯(北京)有限公司)。

柠檬苦素标样(西安开来生物工程有限公司，柠檬苦素，含量大于等于98%);无水乙醇、甲醇、二氯甲烷、浓硫酸、香草醛等化学试剂均为国产分析纯试剂;柠檬采自四川安岳。

1.2 实验方法

1.2.1 柠檬皮渣苦素的提取

称取柠檬粉末5 g，置锥形瓶中加入一定量和一定浓度的乙醇(用保鲜膜包住瓶口)，50 ℃下超声波(400 W)处理一定时间。处理后抽滤，用少量乙醇清洗烧杯，清洗液一并过滤，滤液浓缩至干，用约40 mL 二氯甲烷溶解烧瓶中的残余物，转移至50 mL 容量瓶中二氯甲烷定容至刻度，得待测提取液。

1.2.2 柠檬苦素标准曲线的制备

精确称取柠檬苦素标准品10 mg(精确到0.00001 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得质量浓度为0.2 mg/mL 的标准溶液。分别取柠檬苦素标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容得标准系列浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL。取1.4 mL 0.10 mg/mL 的柠檬苦素标准溶液于试管中，加入0.4 mL 0.02 g/mL 香草醛乙醇溶液振荡混匀，静置2 min，加入浓硫酸0.6 mL，迅速振荡10 s，加入2.5 mL 甲醇溶液混匀显色，二氯甲烷定容至5 mL，静置10 min，在300～700 nm 处进行光谱扫描，观察最大吸收峰波长为547 nm。测定标准系列浓度的吸光度，用最小二乘法作线性回归，得柠檬苦素浓度C与吸光度值A 的标准曲线回归方程为:C=0.223A-0.036，R=0.9981。

1.2.3 柠檬苦素提取得率计算

取1.4mL 柠檬苦素提取液于试管中，按上述方法显色并测定吸光度，计算柠檬苦素提取率。柠檬苦素提取率=C×V/m=C×50/5(mg/g)。

1.2.4 实验设计

在查阅参考文献及前期预实验的基础上，本文主要考察乙醇浓度、提取时间、液固比对提取效果的影响，应用Design Expert 7.0.0 软件，采用Box-Behnken Design 设计实验方案，以液固比(A)、乙醇体积分数(B)、提取时间(C)为影响因素，苦素提取率(Y)为响应值设立处理组，因子编码及水平见表1。

表1 实验因素与水平Table 1 Factors and levels of experiments

2 结果与讨论

2.1 实验结果及数据处理

共设计17个处理组，实验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken 设计方案及响应值Table 2 Box-Behnken experimental design and response values

用Design Expert 7.0.0 软件将表2 中试验数据进行多元回归拟合，得到柠檬苦素提取率对液固比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)的二次多项式回归模型。对所建立的响应模型进行方差分析，结果见表3。由表3 可知，试验选用的模型高度显著(P＜0.01)，说明该模型拟合程度良好，可以用此模型来分析以乙醇为溶剂采用超声波对柠檬皮渣苦素的提取。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

回归模型系数显著性检验结果见表4。由表4可知，模型一次项A、C 较显著(P＜0.1)，二次项B2和C2显著(P＜0.01)，其他不显著(P ＞0.1)。

表4 回归模型系数显著性检验Table 4 Analysis of significance for regression coefficient

2.2 响应面分析

响应面图形是响应值对各因素所构成的三维空间的曲面图，图1、图2 和图3 为液料比(A)、乙醇浓度(B)、处理时间(C)在其中一个固定时，另外两个对柠檬皮渣柠檬苦素提取影响曲面图。比较图1、图2 和图3 的曲面图可知，液固比(A)、超声波处理时间(C)对柠檬皮渣柠檬苦素提取的影响较为显著，表现为曲线较陡峭，乙醇浓度(B)不显著，表现为曲线相对平滑。可能是柠檬苦素类化合物在400W 超声波处理下，在乙醇溶液中浸出速度都很大，故提取乙醇浓度的变化对柠檬苦素提取率影响不显著。比较图1、图2 和图3 的等高线图可以看出液料比(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)的交互影响显著性相似，表现为等高线相对密度相似，这与方差分析结果一致。

图1 乙醇浓度、液固比及其交互作用对提取率的影响Fig.1 Effects of liquid solid ratio，ethanol concentration and their interactions on the extraction yield

图2 液固比、提取时间及其交互作用对提取率的影响Fig.2 Effects of liquid solid ratio，extraction time and their interactions on the extraction yield

图3 乙醇浓度、提取时间及其交互作用对提取率的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration，extraction time and their interactions on the extraction yield

图4 预测值与实验值相关图Fig.4 Correlation plot of predicted extraction yield and actual extraction yield

2.3 模型优化与验证

模型对各实验号的预测值与实验值相关图见图4，图4 可以发现大部分样本点落在45 度的对角线附近，说明模型的预测值与实验值之间误差较小，模型能用于柠檬苦素提取率的预测。在选取的各因素范围内，根据回归模型通过Design Expert 软件分析得出，柠檬苦素最佳提取条件为:液固比为16.80∶1，乙醇体积分数为74.55%，超声波处理时间为36.94 min，提取率理论预测值为1.752 mg/g。而最优工艺条件恰好与表2 中处理号为5、10、11、16 和17的实验条件相近(液固比为15，乙醇体积分数为70%，超声波处理时间为35 min)，这5个实验的提取率分别为1.698、1.725、1.734、1.727 和1.723 mg/g，平均值为1.721 mg/g，平均值与理论预测值为1.752 mg/g 接近，说明响应曲面得出的结论是正确的，即该方程与实际情况拟合很好，响应曲面法适用于柠檬皮渣苦素超声波提取工艺分析和参数优化。

3 结论

本文利用试验设计软件Design Expert，采用Box-Behnken Design 设计实验方案，分析得出柠檬皮渣柠檬苦素超声波乙醇提取的最佳工艺条件，在最佳工艺条件下对柠檬皮渣苦素进行提取，不但提取液柠檬苦素含量最高，而且实验的重现性好，说明响应曲面法得出的结论是正确的，本文得出的柠檬苦素最佳提取工艺具有一定开发价值。

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