海南山苍子挥发油GC-MS 分析及抗肿瘤活性研究

于长江，宋小平，张 鑫，韩长日*，朱林华*

1海南师范大学“省部共建-热带药用植物化学”教育部重点实验室;2 海南师范大学化学与化工学院，海口 571127

山苍子(Litsea cubeba)是我国特有香料植物，别名山胡椒、木姜子，为樟科木姜子属的落叶灌木或小乔木，是一种极具综合利用深加工价值的资源［1］。山苍子根、茎、叶和果实均可入药，是一味传统的中药材，具有抗菌、抗过敏等功效，可用于治疗风寒感冒、劳倦乏力、虚寒型胃痛等疾病。山苍子油在防治害虫、杀菌防霉及防治作物病害等方面具有突出优点，发展前景广阔［2］。山苍子芳香油中富含的柠檬醛是合成紫罗兰酮、甲基紫罗兰酮、二氢大马酮等的原料，也可用于配制草莓、苹果、柠檬等水果型食用香精，柠檬醛在工业上有着广泛的应用范围。

海南是个天然香料大宝库，尤其是各种亚热带香料独具优势。海南的山苍子资源非常丰富，每年6～7 月果实累累，但目前未进行开发利用［3］。本实验研究海南山苍子芳香油的化学成分，测试其抗肿瘤活性，为海南山苍子在医药上的应用提供理论依据。同时采用分子蒸馏技术分离山苍子芳香油，研究山苍子油各组份的抗肿瘤活性，提高山苍子芳香油的经济价值，促进海南山苍子的开发利用。

1 实验部分

1.1 材料

山苍子于海南省采摘，室内阴干保存，经海南师范大学宋小平教授鉴定，样品保存于海南师范大学“省部共建-热带药用植物化学”教育部重点实验室材料库。人肺腺癌细胞(SPCA-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(GSC-7901)和人白血病细胞(K562)由中科院上海生物所提供。细胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.2% NaHCO3的RPM-I 1640 培养液，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.2 仪器与试剂

二氧化碳超临界萃取仪:杭州华黎泵业有限公司;分子蒸馏仪:德国瑞达有限公司;7890-5975 气质联用仪:美国安捷伦公司;高压灭菌锅:日本森展企业有限公司;倒置显微镜:重庆光学仪器厂;ELx800 酶标仪:BioTek 公司;CO2恒温培养箱:日本SANYO 公司;超净工作台:苏州净化设备厂;可调式移液器子天平:Sartious 公司;RPM-I 1640 培养液、胰酶:Gibco 公司;四甲基偶氮唑蓝:MTT，Sigma 公司;超级新生牛血清:杭州四季青生物科技有限公司;二甲基亚砜(DMSO):天津市化学试剂二厂。

1.3 实验方法

1.3.1 山苍子挥发油提取方法

取阴干保存的山苍子503.6 g，在萃取釜温度为45 ℃，压力为30 MP，分离柱1 温度为30 ℃，压力为7.5 MP，分离柱2 温度为25 ℃，压力为4.5 MP，二氧化碳流速为20 kg/h 的条件下超临界1 h，制取芳香油26.5 g，用过滤膜过滤后装样品瓶测试其成分。

1.3.2 山苍子挥发油GC-MS 分析方法

色谱柱为HP-5MS 毛细管柱，固定相为(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷，载气为氦气，EI 230 ℃四极杆150 ℃，进样口温度250 ℃，分流比50∶1，柱初温50℃，保持2 min，3 ℃/min 升温到100 ℃，5 ℃/min 升温到240 ℃保持14 min。通过面积归一化法对鉴定出的化合物进行半定量，检索数据库为NIST 08。

1.3.3 山苍子挥发油对肿瘤活性测定方法

挥发油对四种癌细胞的抑制率(IR)及半抑制浓度(IC50值)测定采用MTT 比色法［4］。人肺腺癌细胞(SPCA-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(GSC-7901)和人白血病细胞(K562)分别以2 ×104个/mL、7 ×104个/mL、4 ×104个/mL 和1 ×104个/mL 接种于96 孔板中。每孔体积180 μL，在CO2培养箱内培养8～12 h，待细胞贴壁后，加入不同浓度药液(板内终质量浓度为1、10、100 μg/mL)取山苍子油20 μL。加药细胞培养44 h 后，每孔加入MTT 溶液(1 mg/mL)50 μL，继续在培养箱内孵育4 h，取出倾去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min 后，使用酶联免疫检测仪于570 nm 测定各孔光吸收值。同时设置空白组(仅加入不含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)，计算细胞增殖抑制率。初筛时以最大浓度检测其抑制率，以抑制率大于50%为有效。抑制率(%)={［A(对照)-A(给药组)］/A(对照)}×100。由初筛所得数据，选取有活性的样品，经稀释后，进一步测定其抑制率，得到半数抑制浓度IC50，即以同一样品浓度的对数值为横坐标，以抑制率为纵坐标，作回归曲线，计算IC50。

抗肿瘤药物疗效的评价标准之一，合成化合物或植物提取物纯品的半数抑制浓度IC50＜10 μM，或植物粗提物的IC50＜20 μg/mL，并有细胞毒性的剂量依赖关系，且最高抑制效率应达80%以上，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用。

2 结果与分析

2.1 山苍子成分解析［5］

在山苍子油中已鉴定出的52 种化合物，占挥发油总量的95.65%，主要成分为6-甲基-5-庚烯-2-酮、D-苎烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、a-柠檬醛、β-柠檬醛，其中柠檬醛的总含量为60.22%。

表1 海南山苍子挥发油化学成分Table 1 Chemical components of the essential oil of Hainan L.cubeba

2.2 山苍子挥发油抗肿瘤活性分析

采用分子蒸馏技术分离山苍子芳香油，包括:一次分馏:蒸馏温度45 ℃、冷却水-5 ℃、压力2 mbar，转数395 rpm、加料速度145 滴/min，接样轻组份(D1)，重组份(R1);二次分流:蒸馏温度60 ℃，冷却水-5 ℃，压力1 mbar，转速395 rpm，加料速度120滴/min，接样柠檬醛(D2)，重组份(R2)。

实验结果显示山苍子挥发油及各组分对癌细胞均显示出一定抑制作用，抗肿瘤半抑制浓度值见表2。数据显示山苍子挥发油对GSC-1 抑制活性比较好，IC50为6.29 μg/mL;组份D1 对K562 抑制活性比较好，IC50为16.6 μg/mL;组份R1 对K562、BEL-7402 的抑制活性比较好，IC50分别为7.76 μg/mL、16.8 μg/mL;组份D2 对K562、BEL-7402 的抑制活性比较好，IC50分别为6.73 μg/mL、14.34 μg/mL;组份R2 对K562、BEL-7402 的抑制活性比较好，IC50分别为5.97 μg/mL、19.18 μg/mL。

表2 抗肿瘤半抑制浓度值Table 2 IC50values of essential oil of Hainan L.cubeba against different cancer cells

3 结论

海南山苍子油主要成分为6-甲基-5-庚烯-2-酮、D-苎烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、a-柠檬醛、β-柠檬醛，其中柠檬醛的总含量为60.22%。鉴定出的52 种化合物，占挥发油总量的95.65%。活性测试结果显示海南山苍子挥发油对人肺腺癌细胞、人肝癌细胞、人胃癌细胞和人白血病细胞有一定抑制效果，其中对人胃癌细胞的抑制活性最好，IC50为6.29 μg/mL。组分D1、R1、D2、R2 对白血病细胞的抑制活性最好，IC50分别为16.6、7.76、6.73、5.97 μg/mL。

海南山苍子挥发油及分离的各组份都显示出很好的抗肿瘤活性，组份D1、R2 是分离柠檬醛的副产品，R2 显示出最好的抗人白血病细胞活性，可以进一步研究开发，提高海南山苍子油的利用价值以及经济效益。

海南山苍子挥发油的生物活性活性是多方面的，在药用上有很大的用途。本实验通过对海南山苍子油有效成分的分析评价及各组份的活性测试，为山苍子资源在创新中成药、天然香料及综合利用等方面提供科学依据。

1 Zhao MQ(赵铭钦)，Shu CT(苏长涛)，Ji XM(姬小明)，et al.Research advance of integrated utilization of Litsea cubeba oil.J Anhui Agric Sci (安徽农业科学)，2007，35:7866-7868.

2 Yu BL(余伯良)，Luo HB(罗惠波)，Zhou J(周健)，et al.Study on the active ingredient of antibiotic activities of Litsea cubeba oil on moulds and the effect on aflatoxin production.J Sichuan Instit Light Ind Chem Technol (四川轻化工学院学报)，2002，15:32-36.

3 Wang ZN(王祝年)，Xiao BS(肖邦森)，Li YL(李渊林)，et al.Cataloguing of spice plants in Hainan island.Chin J Trop Crops(热带作物学报)，2002，(23)4:62-72.

4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

5 Zhou X(周欣)，Mo BB(莫彬彬).The study on chemical components of volatile oil which from Litsea cubeba (Lour.)Pers.growing in Guizhou.J Guizhou Univ(贵州大学学报)，2001，18:45-47.