Fbxw7通过降解c-Myc和Cyclin E诱导胃癌细胞凋亡和生长阻滞

曾长青 黄良祥 黄海啸 陈林昊 郑 羽 池良杰

胃癌（gastric cancer）起源于胃壁最表层的黏膜上皮细胞，其中腺癌约占90%。全世界每年大约新发胃癌100余万，中国占42%，死亡约80万，中国占35%，是胃癌发病率和死亡率最高的国家之一，发病率和死亡率均是世界平均水平2倍多［1］。Fbxw7（F-box and WD repeat domain-containing 7；也称 Fbw7、SEL-10、hCdc4和hAgo）是Skp1-Cul1-F-box（SCF）类泛素连接酶E3复合体中特异性识别底物的关键因子，能够靶向降解Cyclin E，c-Myc，c-Jun和Notch等癌蛋白，是一种广泛的抑癌基因［2］。在许多种人类恶性肿瘤中都发现Fbxw7表达缺失，同时，研究证实下调Fbxw7基因表达可以促进肿瘤细胞增殖［3］，而在肝癌细胞中过表达Fbxw7可以诱导细胞凋亡［4］。本实验初步探讨Fbxw7在胃癌发生、发展中的作用，为胃癌治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 胃癌及对应癌旁组织来源于福建省立医院手术切除标本共20例，其中男14例，女6例，年龄31～68（50±3.5）岁。所有患者术前均未行放、化疗，所有组织标本经术后病理学证实为胃腺癌。所有标本于术中离体30 min内取材，经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片备用。

1.1.2 细胞培养 胃腺癌细胞系MGC-803和AZ521均购自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，MGC-803表达Fbxw7相对较低，AZ521表达Fbxw7相对较高。细胞培养于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中，饱和湿度下培养。稳定传代2～3代后，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.3 主要试剂 DMEM培养基、青/链霉素和0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自Sigma公司；β-巯基乙醇购自Boehinger公司；ECL化学发光试剂盒和PVDF膜购自Millipore公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司；质粒小提试剂盒和慢病毒包装试剂盒购自QIAGEN公司；Fbxw7抗体购自Abcam公司；c-Myc和Cyclin E抗体购自CST公司；β-actin抗体购自Santa Cruz公司；免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）购自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 对石蜡块进行4 μm连续切片制片。经过脱蜡过程后，进行热抗原修和内源性过氧化物酶灭活，100 mL/L山羊血清封闭，1∶100稀释的Fbxw7一抗4℃孵育过夜。以PBS取代一抗为阴性对照。滴加生物素标记的山羊抗鼠二抗工作液，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，滴加DAB显色，苏木苏轻度复染，梯度脱水至透明。显微镜下观察、成像系统拍照。采用染色强度联合阳性细胞百分比进行评分：染色强度分为4等级：0分，阴性；1分，弱阳性；2分，中度；3分，强阳性；阳性细胞百分比分级如下：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51～75%为3分，＞75%为4分。染色强度和阳性细胞百分比评分相乘≥1分则认为Fbxw7蛋白阳性表达［3］。

1.2.2 质粒转染 Fbxw7过表达质粒、空白对照质粒（EV）、Fbxw7 shRNA和阴性对照shRNA（NT-shRNA）由Kanae Yumimoto教授惠赠（Department of Molecular and Cellular Biology，Medical Institute of Bioregulation，Kyushu University）。质粒转染按照 Effectene®Transfection Reagent说明书操作。

1.2.3 Western blot检测 取转染48 h后的细胞，弃培养基，使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，4℃下110 V电压湿转1.5 h。5%脱脂奶粉（TBST溶解）室温封闭，加入1∶1 000稀释的Fbxw7、c-Myc和Cyclin E抗体以及1∶10 000稀释的β-actin抗体，4℃孵育过夜，加入适当（1∶2 500）浓度的二抗，室温孵育2 h。暗室内浸入ECL液显色，并使胶片曝光，全自动X光洗片机洗片。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 离心、收集转染12 h的细胞，，调节细胞密度约为2×105/mL，以200 μL/孔接种于96孔板。96孔板的左上孔设为空白孔，每组设6个复孔。加5 mg/mL MTT溶液20 μL/孔，继续避光培养4 h，弃上清，加DMSO 150 μL/孔，37℃振摇孵育20 min至颗粒溶解。酶标仪上测定各孔490 nm的吸光度（OD490），分析各组细胞活性。

1.2.5 流式细胞术 细胞转染48 h后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1次，再用胰酶消化液解离细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清液收集细胞。用PBS重新悬浮细胞，并计数。取1～5×105细胞悬浮液，1 500 r/min，5 min离心后弃上清液，加入500 μL的1×结合缓冲液。加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL碘化丙啶，移液器轻轻吹打混匀。室温下避光反应5～15 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Fbxw7在胃癌组织中低表达

免疫组织化学法检测Fbxw7在20例胃癌及对应癌旁组织中的表达水平，结果发现Fbxw7在胃癌组织中的表达水平（1.24±0.23）显著低于对应的癌旁组织（7.68±2.13）（n=20，t=8.456，P=0.004）；Fbxw7蛋白主要定位在细胞质和胞膜中（图1）。

图1 Fbxw7在胃癌及对应癌旁组织中的免疫组织化学染色 （SP×400）Figure1 Immunohistochemical staining of Fbxw7 in gastric cancer tissues and normal tumor-adjacent tissues （SP×400）

2.2 过表达Fbxw7下调c-Myc和Cyclin E蛋白表达

采用Fbxw7过表达质粒转染MGC-803细胞，Western blot检测转染48 h后的MGC-803细胞中Fbxw7及其靶蛋白c-Myc和Cyclin E的表达，结果显示Fbxw7蛋白表达明显升高并伴随c-Myc和Cyclin E明显降低（图2）。

2.3 过表达Fbxw7降低细胞增殖能力

采用MTT法连续检测Fbxw7过表达细胞的增殖能力，结果显示相对于空质粒（EV）转染细胞组，Fbxw7过表达后MGC-803细胞增殖能力显著减弱（P＜0.05，图3）。

2.4 过表达Fbxw7诱导细胞凋亡

MGC803细胞转染Fbxw7过表达质粒48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化，结果显示Fbxw7过表达组细胞凋亡较空质粒（EV）组显著增加（P＜0.05，图4）。

2.5 敲低Fbxw7导致c-Myc和Cyclin E蛋白蓄积

Fbxw7 shRNA转染AZ521细胞48 h后，Western blot检测Fbxw7及其靶蛋白c-Myc和Cyclin E的表达，结果显示Fbxw7蛋白表达明显降低并伴随c-Myc和Cyclin E蛋白蓄积（图5）。

2.6 敲低Fbxw7增强细胞增殖能力

采用MTT法连续检测敲低Fbxw7对细胞增殖能力的影响，结果显示相对于阴性对照（NT-shRNA）转染细胞组，敲低Fbxw7后AZ521细胞增殖能力显著增强（P＜0.05，图6）。

图2 MGC-803细胞过表达Fbxw7导致c-Myc和Cyclin E蛋白表达下调Figure2 Fbxw7 overexpression leads to downregulation of c-Myc and Cyclin E protein expression in MGC-803 cells

图3 过表达Fbxw7降低MGC-803细胞增殖能力Figure3 Fbxw7 overexpression decreases MGC-803 cell proliferation

图4 过表达Fbxw7诱导MGC-803细胞凋亡Figure4 Fbxw7 overexpression induces MGC-803 cell apoptosis

图5 敲低AZ521细胞中Fbxw7表达导致c-Myc和Cyclin E蛋白表达上调Figure5 Fbxw7 knockdown leads to accumulation of c-Myc and Cyclin E protein in AZ521 cells

图6 敲低Fbxw7增强AZ521细胞增殖能力Figure6 Fbxw7 knockdown increases AZ521 cell proliferation

2.7 敲低Fbxw7减少细胞凋亡

AZ521细胞转染Fbxw7 shRNA 48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化，结果显示Fbxw7 shRNA组细胞凋亡较阴性对照（NT-shRNA）组显著减少（P＜0.05，图7）。

图7 敲低Fbxw7减少AZ521细胞凋亡Figure7 Fbxw7 knockdown decreases AZ521 cell apoptosis

3 讨论

靶蛋白的泛素化是由功能连续的三个酶介导的：泛素激活酶（E1）、泛素载体蛋白酶（E2）和泛素连接酶（E3）。泛素化底物被26S蛋白酶体选择性的识别和降解［5］。SCF类E3复合体是泛素连接酶（E3）中的一类，由环指蛋白（ring-box 1，Rbx1；也称Roc1和Hrt1）、支架蛋白（cullin1，Cul1）、衔接蛋白（S-phase kinase-associated protein 1，Skp1）和一个 F-box蛋白组成，其中F-box蛋白类决定底物特异性［6］。Fbxw7是F-box蛋白家族的一员，对漂亮新小杆线虫进行遗传分析时，Fbxw7作为LIN-12介导（Notch介导）信号通路的负调节因子首次被发现。Fbxw7在哺乳动物细胞中也与Notch家族蛋白类相互作用，促进其泛素依赖的更新［7］。而且Fbxw7靶向降解数个控制哺乳动物细胞周期进程的蛋白，包括CyclinE、c-Myc和c-Jun，同时 SREBPs（sterol regulatory element binding protein）、mTOR（mammalian target of rapamycin）和PGC-1α（PPARγ-coactivator-1α）等不直接参与细胞周期调控的蛋白也通过Fbxw7靶向降解［8］。

CyclinE、c-Myc、c-Jun和Notch都是原癌基因的产物，Fbxw7能促进这些癌蛋白的降解，因此被认为是一种广泛的肿瘤抑制因子［9］。Yakobori等［10］发现Fbxw7低表达与胃癌淋巴结转移、肿瘤大小和不良预后相关，而且Fbxw7低表达合并p53突变的胃癌患者具有不同的预后不良，提示协同破坏p53和Fbxw7促进肿瘤患者预后不良。另外6%前列腺癌中存在Fbxw7基因位点修饰，Fbxw7亚型差异表达与前列腺癌高分期和复发呈负相关［11］。另外一个团队也证实Fbxw7突变导致的Cyclin E高表达在胰腺癌发展中发挥决定性作用［12］。这些结果提示Fbxw7在多种人类肿瘤发生中作为肿瘤抑制基因发挥功能。本研究应用免疫组织化学技术发现Fbxw7在胃癌组织中的表达明显低于对应的癌旁组织，这与之前的相关报道一致［10，13-15］。在许多种人类恶性肿瘤中都发现Fbxw7表达缺失，包括急性T细胞型淋巴细胞白血病、胆管上皮癌、胰腺癌、肝癌、食管鳞状细胞癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜癌［3］。p53可以直接调控Fbxw7表达［16］，但0～77%的胃癌组织中存在p53突变［17］，而且研究表明6%胃癌组织中存在Fbxw7基因突变［9］，以上两种机制可能是导致胃癌中Fbxw7低表达的原因。Fbxw7调控多种癌蛋白的表达，但在胃癌中其具体的调控靶点和相关通路尚不清楚，国外研究证实应用特异性Fbxw7 siRNA下调Fbxw7基因表达可以导致c-Myc和Cyclin E蓄积并促进胃癌细胞增殖［13］。本研究在胃癌MGC-803细胞中过表达Fbxw7，结果发现Fbxw7下调c-Myc和Cyclin E蛋白表达水平，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，而在AZ521细胞中转染Fbxw7 shRNA后，导致c-Myc和Cyclin E蛋白蓄积，并伴随细胞增殖能力增强和凋亡减少。c-Myc在有丝分裂信号通路和细胞生长过程中发挥重要作用，并参与细胞凋亡信号通路，Cyclin E是细胞周期调控的关键组分，两者在胃癌组织中都表达失调［18-19］。结合以上结论推测Fbxw7在胃癌中作为肿瘤抑制因子发挥功能，其可能通过调节c-Myc和Cyclin E的表达介导胃癌细胞的增殖和凋亡调控。

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