紫草素对鼻咽癌细胞生物学行为影响的研究

陈武兵 金巧智 孙栋勋 蔡志毅

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)为我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，主要发生在我国南方地区，近年来其发病率有逐渐上升的趋势。目前临床主要以高剂量的放疗联合化疗治疗为主，但对于中晚期患者，预后仍不够理想且不良反应大，患者往往难以忍受，且易产生耐药性［1～4］，因此迫切需要研究和开发高效低毒的新药。紫草素即是从中药紫草科植物紫草的根中提取的一种低分子萘醌类化合物，具有较广的生物药理学活性，大量医学实验研究表明，其可在多个层面上抑制多种肿瘤的发生与发展［5］。

紫草素在对人宫颈癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、恶性黑色素瘤等多种肿瘤细胞增殖与凋亡方面的研究已有相关文献报道［6～9］。但是紫草素对于人鼻咽癌作用的相关国内外研究报道甚少，所以本研究旨在探究紫草素对人鼻咽癌CNE－1细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞迁移能力等生物学行为的影响，以期为进一步研究紫草素抑制鼻咽癌细胞生长与侵袭的作用机制提供基础研究依据，初步探索紫草素治疗鼻咽癌的可能性。

材料与方法

1．实验材料:人高分化鼻咽癌细胞株CNE－1购于中国科学院上海细胞库;紫草素购于Sigma公司;RPMI 1640培养基、胎牛血清、双抗均为Gibco公司产品;胰蛋白酶－EDTA消化液、细胞冻存液、PBS缓冲液、Hoechst33258染色试剂盒、Annexin V－FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒均购自南京凯基生物公司;MTT试剂盒、抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物公司。

2．细胞培养:CNE－1接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中(pH7．2)，在37℃、含5%CO2湿润空气的恒温密闭式培养箱中培养，每24～48h换培养液，经3次传代稳定后取对数生长期细胞进行实验。

3．紫草素培养液配制及实验分组:将粉末状进口紫草素先以1mg/ml的浓度溶于新鲜配制的培养液中形成母液，然后依次稀释配制成1、5、10、15 μg/ml浓度的工作液，抽滤灭菌，4℃避光保存。实验分为无药物处理组(对照组)和药物处理组(实验组)。以下各实验所应用的药物浓度及作用时间均为预实验筛选所得到的最佳作用浓度与作用时间。

4．利用细胞生长曲线绘制法及MTT法，分别进行细胞增殖分析。(1)细胞生长曲线法:将对数生长期的CNE－1细胞接种于24孔培养板，每孔接种3×104细胞于0．5ml RPMI 1640培养基中培养过夜。第2天开始，换液后分别在细胞中加入含不同浓度紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培养基 0.5ml，对照组使用不含紫草素的培养基，从第3天起，对照组和各实验组每天收集4个复孔的细胞用guava easyCyte 8HT流式细胞仪分别进行计数，共计数4天(第3天设定为d1，第4天为d2，第5天为d3，第6天为d4)，实验独立重复3次。然后以作用时间作为横坐标(即d0～d4)，以对应每天的细胞数平均值作为纵坐标，绘制细胞生长曲线图。(2)MTT法:取对数生长期细胞接种于96孔培养板中(1×104个/毫升)，每孔100μl，常规培养12h，换液后分别加入含不同浓度的紫草素(1、5、10、15μg/ml)的培养基 100μl，对照组培养基不含紫草素，继续孵育48h，随后每孔细胞加入10μl MTT试剂，作用4h后加入100μl formanzen溶解液，继续作用4h后用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定光吸收值(D)。每组设置4个复孔。以对照组细胞的平均D值为100%活细胞数目，其他各实验组细胞的平均D值分别与对照组细胞的平均D值相除，求出各实验组细胞的相对活细胞数目。最后，以相对活细胞数目为纵坐标、以不同浓度紫草素为横坐标进行制图。

5．荧光显微镜观察细胞凋亡:将对数生长期细胞以2×105个/毫升接种于放有盖玻片(多聚赖氨酸包被)的6孔板内，培养12h后换液加入含紫草素终浓度为5、10μg/ml的培养基1ml，作用48h后，参照南京凯基生物的细胞凋亡荧光Hochest33258试剂盒说明书进行操作，在荧光显微镜下观察、摄像。每个浓度设3个复孔。

6．流式细胞仪检测细胞周期变化:取对数生长期细胞，每孔5×105个细胞接种于6孔板中。培养24 h后，实验组加入紫草素1、5、10μg/ml，对照组不加药物。分别培养 48h，收集培养细胞，用预冷的PBS洗涤2次，70%乙醇(4℃预冷)固定细胞过夜，离心弃乙醇后用预冷的PBS洗涤2次，倒掉上清，每管加入PI染液，4℃染色30min后400目筛网过滤上机检测，在流式细胞仪上用激发波长EX=488nm，发射波长EM=530nm测定各组细胞DNA含量的变化，利用计算机细胞周期分析软件计算出各时相分布的百分比(%)，实验重复进行4次。以增殖指数(proliferation index，PI)表示细胞的增殖活性，PI公式如下:

7．划痕擦伤迁移实验检测紫草素对CNE－1细胞迁移能力的影响:在6孔板背面画直线做标记，取对数生长期的CNE－1细胞(5×105个/毫升)接种于做了标记的6孔板中，常规培养至细胞融合达80% ～90%左右时，弃去培养基，PBS轻洗细胞2次后，用100μl移液器枪头在培养孔的中央沿纵轴方向划以直线(长50mm，宽1．2mm)。用无菌PBS液轻洗细胞2次，以去除已被刮除的漂浮细胞。再向每孔中加入不同浓度紫草素(1、5、10、15μg/ml)，对照组常规培养，分别于 24、48h时于倒置显微镜下观察划痕处细胞的生长状况并拍照。每组检测5个视野，每组4个复孔，计算迁移率=(1－实验组/对照组)×100%。

8．统计学方法:采用SPSS 17软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两样本均数比较采用配对t检验;多样本均数比较采用单因素方差分析。P＜0．05为差异具有统计学意义。

结 果

1．紫草素抑制鼻咽癌细胞株CNE－1细胞增殖:流式细胞仪计数绘制细胞生长曲线见图1，结果显示，从第1天起，各浓度紫草素处理后CNE－1细胞生长开始变慢。从第2天开始，各实验组细胞生长速度明显变慢，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0．05)，且随着浓度与时间的增加，其生长抑制程度也逐渐加重。MTT 法测定结果如图 2，1、5、10、15μg/ml紫草素分别处理CNE－1细胞48h后，CNE－1细胞的相对活细胞数目明显减少，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)，且与紫草素浓度呈递降关系。

图1 紫草素处理CNE－1细胞后对细胞生长的影响

图2 MTT法检测各浓度紫草素处理CNE－1细胞48h后的细胞增殖变化

2．紫草素处理后的细胞凋亡形态学观察:如图3所示，经Hoechst33258染色的CNE－1细胞对照组呈淡蓝色荧光，细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀。实验组出现较多的凋亡细胞，表现为亮蓝色的核固缩和核碎裂呈分叶状，其染色质分布不均匀，部分细胞核缩小，染色质凝聚，呈颗粒团状分布，有的核碎裂形成多个球形颗粒。

图3 紫草素(1、5、10μg/ml)作用细胞24h后的Hoechst染色结果(×400)

3．紫草素对鼻咽癌细胞周期的影响:经不同浓度紫草素处理后，CNE－1的细胞周期分布发生了明显的变化(表1)。结果显示，实验组(1、5、10μg/ml)的增殖指数分别为 56．32%、45．77%、35．04%，其中 5、10μg/ml组分别与对照组的58．64%相比，差异有统计学意义(P＜0．05)。同时这两个实验组的G0/G1期比例升高，S期比例降低，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)，并且随着药物浓度增大，G0/G1期细胞的比例随浓度依赖性增大。而1μg/ml实验组与对照组比较细胞周期分布无统计学差异(P＞0．05)。细胞周期变化(%，x ± s，n=4)

表1 不同浓度紫草素作用CNE－1细胞48h的

4．CNE－1细胞的划痕擦伤迁移实验:如表2所示，培养细胞24h和48h后，CNE－1细胞发生迁移，对照组分别迁移了1．7、2．3μm，而加入不同浓度紫草素后，细胞的迁移能力较对照组明显减弱，当用15μg/ml紫草素作用CNE－1细胞24h时，细胞迁移率为23.5%，即紫草素对CNE－1细胞迁移抑制率达76．5%。

表2 不同浓度紫草素作用CNE－1后细胞迁移的距离变化

讨 论

从天然产物中寻找高效低毒的中药活性成分，是近年来抗肿瘤药物研究热点之一［10］。紫草素是中药紫草的有效成分之一，体外研究发现紫草素能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡。

抑制肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡是不同作用机制的抗癌药物发挥疗效的共同途径。本研究结果显示，CNE－1细胞是一株分裂增殖旺盛的细胞。但经不同浓度紫草素处理后，通过绘制细胞生长曲线及MTT法检测细胞相对存活率，显示各浓度组紫草素对CNE－1细胞的抑制率差异有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)，提示紫草素在一定浓度范围内能显著抑制CNE－1细胞生长，并呈浓度与时间依赖性趋势。

细胞凋亡是机体的一种细胞程序性死亡，与肿瘤的生长及发展密切相关，凋亡的抑制是鼻咽癌发生发展的重要因素之一［1，11，12］。多数的抗肿瘤药物都是通过激活凋亡通路引发细胞凋亡而达到治疗效果的［13，14］。考察和鉴定 CNE －1细胞经紫草素诱导处理前后的细胞形态变化，是判断细胞是否凋亡的一个重要指标。本研究通过Hoechst33258染色在荧光显微镜观察结果显示，1、5、10μg/ml实验组中可看到较多的典型凋亡细胞特征:明显的核仁减少、染色深、染色体浓缩、边集，核裂碎，呈大小不等、形态不规则的碎片状，并有凋亡小体形成。以上特征说明紫草素具有诱导人鼻咽癌CNE－1细胞凋亡的生物学效应。

细胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和分裂期(M期)，其失控可造成细胞恶性增殖［15］。其中G1期的长短在很大程度上决定了细胞周期的长短，即细胞增殖的速度。紫草素能否通过影响细胞周期的分布从而抑制CNE－1细胞增殖是本研究内容之一。本研究表明5、10μg/ml紫草素实验组细胞周期分布发生了明显的变化，随着浓度的升高，G0/G1期比例逐渐升高，S期比例逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，细胞周期被阻滞于G0/G1期。同时5、10μg/ml组的增殖指数分别为45．77%、35．04%，与对照组的 58．64%相比差异有统计学意义(P＜0．05)。提示紫草素可通过阻滞CNE－1细胞周期于G0/G1期来抑制细胞增殖分裂。

肿瘤的侵袭与转移是肿瘤的主要恶性标志，只有进一步阻断肿瘤转移的发生才更有意义。结果显示实验组划痕处的空白未见明显缩小，而对照组划痕两侧的细胞已基本覆盖了划痕处的空白，且紫草素作用后CNE－1细胞迁移率明显下降，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0．05)，表明紫草素能明显抑制CNE－1细胞迁移。研究结果显示，紫草素能体外抑制人鼻咽癌CNE－1细胞的生长、阻滞CNE－1细胞周期于G0/G1期、诱导细胞凋亡并抑制细胞迁移能力，使得紫草素有可能成为治疗鼻咽癌的一种新型抗肿瘤候选中药，同时也为鼻咽癌的临床防治工作提供了重要的基础实验研究依据。

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