天山雪莲细胞培养物多糖对免疫介导的再生障碍性贫血模型小鼠的治疗作用研究

袁绍鹏 陈日道 史 记 白金叶 玄玲玲 戴均贵 侯 琦

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA，以下简称再障)是由多种原因引起的造血干细胞数量下降，功能异常，从而导致机体血细胞减少的一种病症［1，2］。目前的临床和分子机制研究表明，AA发病机制除与造血干细胞自身缺陷、造血组织微环境损伤有关外，免疫系统失调在AA的发生、发展中起着重要的作用，多种免疫细胞和炎症因子参与调控AA的发病机制［3，4］。T细胞分化和亚群异常、炎症因子调控失常、Fas/FasL系统和活化T细胞介导的细胞凋亡、免疫遗传因素等免疫机制紊乱，最终引起造血干/祖细胞的减少和(或)缺陷，从而引发造血衰竭［5］。CD34蛋白属于黏附分子中的黏蛋白样家族，存在于造血干细胞和原始细胞表面，被视为骨髓造血干细胞标志之一，可调控早期造血［6］。与正常骨髓CD34+细胞相比，AA患者的CD34+细胞凋亡比例高于正常人，因此，抑制CD34+细胞凋亡，促进其数量增加及活化将在AA的治疗中发挥重要的功能［7］。

天山雪莲(Saussurea involucrata Kar．et Kir．)为菊科风毛菊属植物，主产于新疆、西藏等地，民间多用于风湿性关节炎、散热除湿、活血通络、抗疲劳等症的治疗。野生天山雪莲次生代谢产物成分复杂，具有药理活性的化合物主要集中在黄酮、生物碱和多糖类［8］。由于野生雪莲生境特异，生长缓慢，人工栽培困难，加上长期以来对雪莲的掠夺性采挖，造成野生资源的严重匮乏，近年来，国内外的研究人员开展了植物组织细胞培养等研究工作［9］。药理研究表明，天山雪莲培养物与野生天山雪莲具有同样的抗炎、镇痛等作用。既往研究多关注野生天山雪莲以及天山雪莲培养物的免疫调节、镇痛等功能，但对其治疗再生障碍性贫血等活性，特别是天山雪莲培养物的多糖成分对再生障碍性贫血作用甚少报道。本实验主要研究及观察天山雪莲细胞培养物多糖对辐射免疫介导的再生障碍性贫血模型小鼠的治疗作用，对模型小鼠的免疫功能及造血功能进行初步研究，旨在探讨雪莲多糖提取物治疗再障的疗效。

材料与方法

1．实验动物:DBA/2小鼠，20 ～22g，雄性，SPF 级，由中国医学科学院实验动物研究所提供［实验动物合格证:SCXK－(京)2009－0007］。BALB/c小鼠，20～22g，雄性，SPF 级，由中国医学科学院实验动物研究所提供［实验动物合格证:SCXK －(京)2009－0007］。

2．试剂和实验设备:天山雪莲细胞培养物多糖(简称XL)，由本所戴均贵研究员课题组提供。天山雪莲细胞培养:细胞培养采用附加30g/L sucrose，0．5mg/L NAA(α－naphthalene acetic acid)，0．5mg/L 6 － BA(6 － benzyl aminopurine)，0.2mg/L 2，4－D(2，4－dichlorophenoxyacetic acid)的 MS培养基，于黑暗下摇床旋转振荡培养，摇床转速为110r/min，培养温度为25±1℃。多糖的制备:称取天山雪莲干燥细胞培养物，95%乙醇回流脱脂，挥干溶剂，采用10倍水85℃浸提3次，每次2h，减压过滤，合并滤液，减压浓缩，加入无水乙醇至醇浓度为80% 沉淀多糖，4℃静置24 h，减压过滤沉淀，无水乙醇洗涤，低温干燥后得到雪莲粗多糖。阳性对照药:再造生血片(简称生血片)，生药含量 0．7克/片，国药准字Z22025856，由辽源誉隆亚东药业有限责任公司生产，批号:110101。Co60辐照装置(北大辐射中心);血细胞分析仪(中国医学科学院实验动物研究所安评中心)。

3．动物模型建立方法:(1)动物分组:对照组进行假照射，AA模型组和给药组按照模型制备方法造模，给药后每周称重1次。BALB/c小鼠，随机分为4组:①正常对照组(Control组)，20只;②模型对照组 (Model组)，20只;③再造生血片组(中药对照组)，20只;④XL组，20只。(2)AA动物模型制备:①胸腺细胞混悬液的制备:DBA/2小鼠，断颈处死，75%乙醇浸泡消毒后，在超净台中无菌取出胸腺，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，除去黏附的结缔组织、剪碎、轻磨、200目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性(95%以上)，计数后用RPMI 1640培养液调细胞浓度为5×106cell/ml，置CO2孵箱中待用;②Co60γ射线的照射:BALB/c小鼠，给予4．0Gy剂量Co60源γ射线全身照射。另取BALB/c小鼠，进行假照射，为 Control组;③小鼠尾静脉注射胸腺细胞混悬液:BALB/c小鼠于射线照射后的当天，由尾静脉注射上述新鲜配制的胸腺细胞悬液0.2毫升/只，含细胞数为1×106。

4．给药方式和初始剂量:各组动物分别于造模当日开始灌胃给药，每天灌胃2次，连续给药14天。各组每次给药剂量依次为:再造生血片组3．8g/kg;XL组500mg/kg。

5．指标检测:(1)外周血常规指标测定:小鼠于末次给药30min后，眼眶取血约0．2ml，置抗凝管中，混匀，在血细胞分析仪上进行血常规测定，包括红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、网址红细胞百分比等。(2)骨髓免疫学和病理分析:小鼠断颈处死，取出右侧股骨，置冰上，按统一尺度截取股骨干部分(去除两端)，用800μl胎牛血清冲出全部骨髓，离心后重悬，吸取500μl骨髓细胞悬液，以FITC标记的抗小鼠CD34单克隆抗体标记细胞，进行 FACS检测，检测细胞膜CD34表达及荧光信号强度。各组股骨标本经10%甲醛固定，5% 硝酸脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，HE染色，光镜检查并拍照。(3)动物脏器指数测定:处死小鼠后，对小鼠的体重、脾脏和胸腺进行称重，计算脾脏指数及胸腺指数。

结 果

1．动物体重、脾脏及胸腺指数的变化:各组动物体重、脾脏及胸腺指数的变化相比见表1。与对照组相比，AA模型组的体重、脾脏和胸腺指数均明显降低。与模型组相比，XL组给药后，明显促进小鼠脾脏指数(P ＜0．05)。

表1 小鼠体重、脾脏及胸腺指数(±s，n=20)

表1 小鼠体重、脾脏及胸腺指数(±s，n=20)

与对照组相比，*P ＜0．001;与 AA模型组相比，#P ＜0．05

组别 体重(g) 脾脏指数(mg/10g体重)胸腺指数(mg/10g体重)对照组20．014 ±1．096 34．923 ±3．586 17．093 ±2．925 AA 模型组 18．767 ±1．302 29．180 ±5．732* 12．39 ±2．802*生血片组 19．344 ±1．077 31．599 ±5．912 14．524 ±3．234#雪莲多糖组 18．833 ±1．733 34．173 ±11．385#11．608 ±3．097

2．血常规细胞分类计数测定:与正常对照组相比，Co60辐照兼免疫介导的再生障碍性贫血模型组与对照组相比，红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数(P＜0．001)和网织红细胞百分比明显降低(P＜0．05)，各组数据比较有统计学差异。与之相比，生血片和XL明显促进了血液中红细胞和血红蛋白含量，有统计学差异(表2)。

表2 小鼠外周血常规及网织红细胞计数(±s，n=20)

表2 小鼠外周血常规及网织红细胞计数(±s，n=20)

与对照组相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．001;与 AA 模型组相比;#P ＜0．05，##P ＜0．01

组别 WBC(109/L) RBC(1012/L) HGB(g/L) PLT(109/L)RET%对照组 8．5 ±2．8 10．8 ±0．3 170．3 ±4．7 728．1 ±135．9 2．7 ±0．5 AA 模型组 2．6 ±1．8＊＊ 8．5 ±0．7＊＊ 137．7 ±10．3＊＊ 558．4 ±149．7＊＊ 3．6 ±1．6*生血片组 2．4 ±1．7 9．0 ±0．4## 147．1 ±7．1## 679．0 ±258．3# 3．7 ±0．9雪莲多糖组 2．2 ±1．6# 9．0 ±0．5## 146．9 ±11．1#508．7 ±143．9 3．0 ±1．4

3．骨髓造血祖细胞检测结果:为进一步证明XL多糖提取物对小鼠骨髓造血功能的改善活性，笔者提取小鼠骨髓细胞，对骨髓的造血祖细胞生物标志物CD34的表达进行了流式检测。实验结果显示，与正常对照组相比，模型组CD34+阳性细胞所占比率降低，且细胞数明显减少。给予药物治疗后，多糖提取物以及阳性药再造生血片均提高了CD34+造血祖细胞在骨髓总细胞中所占的比率 (图1)，以及CD34+阳性造血细胞数目(图2)。

图1 小鼠骨髓细胞CD34+流式检测

4．病理分析结果:骨髓病理学检查结果显示，4Gy辐射照射可诱发小鼠骨髓造血功能病理学改变，表现为骨髓空虚，造血组织不同程度减少，可见广泛脂肪细胞浸润，白系细胞明显减少，骨髓红/白细胞比例失调。骨髓血窦明显扩张、充血和片状出血。与模型组相比，XL多糖治疗组和再造生血片组可不同程度减轻辐射照射诱发小鼠骨髓造血功能病理学改变，其病理学结果见图3。

图2 小鼠骨髓CD34+阳性造血细胞统计

图3 小鼠骨髓病理学观察结果(HE，×100)

讨 论

再生障碍性贫血是一组以造血组织功能衰竭为特征的综合征，对外周血常规检测和骨髓病理分析是从动物模型进行评价的基本方法［4］。本次实验中，与正常对照组相比，Co60辐照兼免疫介导的再生障碍性贫血模型组与对照组间血常规红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数和网织红细胞百分比等各组数据有统计学差异(P＜0．05)，说明笔者成功建立了小鼠再生障碍性贫血模型。在外周血常规测定结果中，阳性对照药再造生血片(7g/kg)在给药14天后，血常规红细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、网织红细胞计数等各组数据有显著的统计学差异(P＜0．05)，网织红细胞百分比相对模型也有所提高，证明再造生血片的治疗活性在本次实验中得到验证。雪莲多糖(XL)在给药14天后，与AA模型组相比，红细胞计数和血红蛋白含量有比较明显的提升，且与模型组相比有统计学差异(P＜0．05)，以上结果提示化合物对该模型治疗有一定的改善活性。

为进一步证明雪莲多糖提取物对小鼠骨髓造血功能改善的活性，笔者对骨髓的造血祖细胞及其生物标志物CD34的表达进行了流式检测。CD34分子是高度糖基化的跨膜糖蛋白，其选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失［10］。实验观察到模型组与正常对照组相比，CD34+细胞所占比率降低且细胞数明显减少，证明辐射对于小鼠骨髓祖细胞具有明显的破坏作用。给予受试化合物治疗后，无论是对照药物再造生血片，还是受试药物雪莲多糖均可促进CD34+细胞在骨髓总细胞中所占比率，这一结果初步证明雪莲多糖对CD34+造血祖细胞的成熟与分化具有较明显的活性。

小鼠骨髓病理学检查结果显示，4Gy辐射照射可诱发小鼠骨髓造血功能病理学改变，表现为骨髓空虚，造血组织不同程度减少，可见广泛脂肪细胞浸润，骨髓红/白细胞比例失调。骨髓血窦明显扩张、充血和片状出血，相对于模型组，雪莲多糖和阳性药生血组可不同程度减轻辐射照射诱发小鼠骨髓造血功能病理学改变。这一结果与李永萍等［11］报道再生障碍性贫血患者经免疫抑制剂环孢素A治疗前后骨髓活检的病理改变情况相近，证明雪莲多糖提取物多糖对再生障碍性贫血小鼠模型有治疗活性。

综合以上实验结果，笔者的研究成功构建了辐射免疫介导的再生障碍性贫血的小鼠模型，并且初步评价了雪莲多糖提取物多糖对于该模型的治疗效果。笔者的结果证明雪莲多糖对于治疗辐射免疫介导的再生障碍性贫血小鼠具有较明显的治疗改善活性，后续实验有待进一步研究探索药物剂量与药效及药物的安全性之间的关系。

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11 李永萍，黄维彦，顾凤兰，等．再生障碍性贫血治疗前后骨髓病理改变分析［J］．医学研究杂志，2006，(4):27－28