量子点联合磁微粒技术检测HBsAg方法的建立及评价

何紫琪 李从荣 杨艳兵 吴 青 余 华

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)因其发病率高、传染性强、传播面广，已成为全球性的公共卫生问题。据WHO报道，全世界大约有20亿人曾经感染过HBV，超过2．4亿的患者发展为慢性化，每年约有60万人因急、慢性HBV感染而死亡［1］。乙型肝炎患者主要集聚在亚洲，该地区大多数人在儿童时期就感染HBV，8% ～10%的成人发展为慢性感染者，在中国更为严重［1］。HBV主要通过血液传播，因此要对献血员进行严格的HBsAg筛查，国家卫生和计划生育委员会(原卫生部)出台的《献血者健康检查要求》规定:献血者要进行HBsAg的检测。HBsAg是HBV感染最早出现的免疫学标志物，HBsAg检测可以缩短病原检出的“窗口期”，也能避免感染恢复后假阳性结果的产生，是病原体诊断的趋势所在。本研究拟利用量子点与磁微粒的特性，建立一种便捷、高灵敏度的HBsAg的检测方法。

材料与方法

1．试剂和仪器:发射波长为605nm的链霉亲和素化CdSe/Zns硒化镉量子点(武汉珈源量子点公司)、粒径3 μm的xMagTM异硫氰酸根末端磁微粒(陕西北美基因股份有限公司)、HBsAg adr protein、生物素化兔抗 HBsAg－IgG、鼠抗 HB-sAg－IgG(英国Abcam公司)。DDHZ－300型恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂)、磁选分离器(西北美基因股份有限公司)、EURO StarⅡ型荧光显微镜(德国EURO公司)、BIORAD680型酶标仪(美国BIO RAD公司)。

2．方法:(1)磁微粒(MMS)与抗体偶联:严格按照说明书进行MMS的活化、抗体偶联、清洗和封闭，分别以不同浓度的鼠抗 HBsAg－IgG 与 MMS偶联，以(OD原始抗体－OD清洗液)/OD原始抗体计算连接效率，并选择最合适的抗体浓度。(2)量子点(QD)与抗体连接方法学的建立:用pH值7．2的PBS缓冲液以1∶500稀释链霉亲和素化的量子点，4℃保存备用。用不同浓度生物素化兔抗HBsAg－IgG连接QD，37℃振荡反应15min;将QD－单抗复合物进行高速离心，取上清液行蛋白含量检测，以(OD原始抗体－OD清洗液)/OD原始抗体计算连接效率，并选择最适抗体浓度。(3)HBsAg检测体系的建立:取5μl MMS－单抗复合物与100μl QD－多抗复合物置于1．5ml EP管内，加入不同浓度的HBsAg，用正常人血清作为阴性对照，37℃振荡反应，分别于5、10、20、30、40、60、120min 时间点进行磁分离并洗涤，重悬至100μl。取20 μl于荧光显微镜下检测荧光。(4)临床应用评价:随机抽取笔者医院HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗体阳性患者的血清，以及脂血、溶血、黄疸标本，用上述方法检测，观察有无交叉反应。随机抽取笔者医院HBV DNA阳性、阴性患者血清标本各60例(经qPCR定量)，用上述方法检测，并与qPCR、ELISA法比较，评价其HBsAg的检测效率。

3．统计学方法:数据处理采用SPSS 17．0软件，不同方法检测率的比较采用χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．MMS、QD偶联抗体最佳浓度:MMS偶联鼠抗HBsAg－IgG的效率在其浓度≤50μg/ml时，维持在43% ～56%，当抗体浓度超过50μg/ml时，MMS偶联效率降低，故以50μg/ml作为偶联磁微粒的抗体最佳浓度。QD偶联生物素化兔抗HBsAg－IgG的效率在其浓度≤25μg/ml时，维持在37% ～49%，当抗体浓度超过25μg/ml时，QD偶联效率降低，故以25μg/ml作为偶联量子点的抗体最佳浓度。

2．HBsAg检测体系:观察免疫反应时间对检测结果的影响发现，30min后可观察到稳定的荧光。当HBsAg浓度为1ng/ml时，可以检测到荧光。当浓度≥30ng/ml时，镜下观察荧光趋于稳定，认为抗体已完全消耗。荧光显微镜下的观察结果见图1。

图1 荧光显微镜下量子点磁微粒抗原复合物

3．临床应用评价:HAV－IgM、HCV核心抗原及TP抗体阳性患者的血清标中均未发现荧光，溶血、脂血、黄疸标本中也未检出荧光。60例HBV DNA阳性患者血清中有4例未检出荧光，60例阴性患者血清检有8例检出荧光，ELISA法检测结果与本研究方法结果一致(表1)(P＜0．05)。以荧光定量PCR方法作为参照方法，本方法检测HBsAg的敏感度、特异性分别为 93．3%(56/60)、86．7%(52/60)。

表1 临床应用评价

讨 论

随着医学的发展，大量患者通过输血治疗缓解病情、挽救性命，然而，输血相关的感染性/非感染性危害(病毒感染、急性肺损伤、溶血反应和败血症)一直困扰着临床输血工作［2，3］。因此输血安全是输血医学的基石，也是当前全社会关注的焦点问题。输血安全要做到以下4点:①保证献血者的安全;②杜绝输血传播疾病的发生;③保证输血操作准确无误;④减少输血不良反应的发生。其中杜绝经血液传播疾病，做好无偿献血的检测工作，是保证血液质量及输血安全的关键。

虽然血液筛查已极大地降低了输血传播疾病的风险，但由于“窗口期”的存在，早期感染会出现漏检的现象，而单纯依靠感染恢复后的抗体又可能出现阳性误判。病毒效价、免疫沉默性感染、病毒变异以及难以最终消除“窗口期”等因素的存在，输血相关传染病还是时有发生［4］。抗原检测能直观、准确的检出病原体的感染，HBsAg在输血后50～60天首先被检测到，可以缩短病原检测的“窗口期”。在检测出HBsAg的前几周，血清中可检测到低水平病毒;在血清阳转前，HBV DNA增长速度慢于 HCV和HIV，HBV感染的窗口期，由于HBV DNA水平相对较低(平均＜1000拷贝/毫升，范围1～2400拷贝/毫升)，核酸检测技术仅能检出小部分假阴性献血员。虽然核酸检测技术是一种核酸检测的重要方法，其敏感度、特异性均较高，但其检测仪器、技术及成本均高，基层单位不能常规开展该项目［5］。胶体金检测技术虽然简便快捷，但其敏感度低、假阴性率高，而且成本较高，不适宜作为献血人员HBsAg的初筛方法。

QD具有独特的光谱特征和光化学稳定性，因而受到研究者的重视，目前在医学领域主要用于体内成像、药物缓释、红外热疗及固相免疫组化分析等［6～8］。MMS具有磁响应性，在磁场中会产生聚集，将其与相应抗原或抗体相连，制作成能捕获不同目标的免疫磁微粒，在磁场的作用下，便能达到分离结合被检物量子点的目的［9］。量子点与磁微粒可连接多种生物活性基团，如抗体，通过抗原抗体反应即可获得量子点磁微粒与抗原抗体的复合物，利用磁微粒的可富集特性，经过磁场聚集后放大量子点的荧光信号，达到高敏感度检测目标抗原的目的。合理利用量子点与磁微粒的特性，可以不依赖特殊仪器扩增标本而放大信号，从而在短时间内高敏感度检出目标抗原。

本研究采用抗HBsAg的异源单克隆抗体分别偶联QD、MMS，以双抗体夹心法结合待测标本中的HB-sAg，利用磁微粒在磁场中的富集特性，在液相中聚集大量抗原，提高了检测的敏感度，本研究方法对HB-sAg的最低检出浓度为1ng/ml。此外，由于QD的荧光强度高，光化学性质稳定，荧光淬灭作用小。偶联蛋白后的MMS也可冷藏保存，因此，可预先完成QD及MMS的偶联标记，然后进行处理标本及检测目标抗原，大大缩短检测时间，检测时间约为40min，较ELISA法可缩短2/3时间。由于本方法是基于量子点荧光信号直接检测目标抗原，而非检测吸光度，因而对标本的要求较低，不受脂血、溶血、黄疸等因素影响，具备良好的特异性。

以荧光定量PCR方法为参照方法，本方法检测HBsAg的敏感度、特异性均较高，而且与ELISA法检测结果无差异。HBV DNA阳性患者血清中有4例未检出HBsAg，究其原因可能是机体产生抗体，清除了HBsAg，HBsAg蛋白变性。HBV DNA阴性患者血清检有8例检出HBsAg，原因可能有机体产生e抗体，病毒被清除，病毒处于非复制期。本研究建立的方法检测结果与ELISA一致，但是检测速度快，与荧光定量PCR技术相比，其成本低，操作简便，对实验室及从业人员要求低，可用于献血、输血人员HBsAg的筛查。

磁微粒、量子点标记抗体直接荧光检测HBsAg操作简便、无需特殊仪器，敏感度也较高，在流动献血车及爱心献血屋的HBsAg人群筛查中有着巨大的潜力和应用前景。

1 World Health Organizaion．Hepatitis B［EB/OL］．2012．http://www．who．int/mediacentre/factsheets/fs204/en/

2 Alter HJ，Klein HG．The hazards of blood transfusion in historical perspective［J］．Blood，2008，112(7):2617－2626

3 Vamvakas EC，Blajchman MA．Transfusion－related mortality:theongoing risks of allogeneic blood transfusion and the available strategiesfor their prevention［J］．Blood，2009，113(15):3406－3417

4 Gallarda JL，Dragon E．Blood screening by nucleic acid amplification technology:current issues，future challenges［J］．Mol Diagn，2000，5(1):11－22

5 蒲晓允．现场快速检验［M］．重庆:重庆出版社，2003

6 Yu HW，Lee J，Kim S，et al．Photoelectronic characterization of IgG antibody molecule－quantum dot hybrid as biosensing probe［J］．Nanotechnology，2010，21(42):425－501

7 Biju V，Itoh T，Anas A，et al．Semiconductor quantum dots and metal nanoparticles:syntheses，optical properties，and biological applications［J］．Anal Bioanal Chem，2008，391(7):2469 －2495

8 Ghasemi Y，Peymani P，Afifi S．Quantum dot:magic nanoparticle for imaging，detection and targeting［J］．Acta Biomed，2009，80(2):156－165

9 De Dios AS，Díaz －García ME．Multifunctional nanoparticles:analytical prospects［J］．Anal Chim Acta，2010，666(1 －2):1 －22