星点设计－效应面法优选湖北海棠叶总黄酮的提取工艺

郭东艳 王 幸 唐志书 汪鋆植

湖北海棠［Malus hupehensis(Pamp．)Rehd．］别名甜茶果、泰山海棠，为蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)植物［1，2］。原产湖北省西部神农架林区、宜昌、恩施等地，湖北海棠叶是湖北人常饮用的凉茶，也是土家族常用的药物，收载于《湖北省中药材质量标准》(2009年版)，具有养肝和胃、生津止渴、消积化滞等功效，用于急慢性肝损伤、慢性肝炎、脂肪肝治疗［3，4］。有关湖北海棠叶总黄酮文献报道较少，因此本研究采用星点设计－效应面法优选湖北海棠总黄酮的提取工艺，以期为今后的开发研究奠定基础。

材料与方法

1．仪器:Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(G1311C型四元泵，G1329B型进样器，G4212B型二极管阵列检测器);UV－1102型紫外可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司);GB－204型电子天平(瑞士);HH－2型恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。

2．试药:湖北海棠叶［购自湖北神农架，经陕西中医学院王继涛老师鉴定为苹果属(Malus Mill．)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp．)Rehd］的干燥叶。根皮苷对照品(自制，经HPLC检测含量＞98%);甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

3．湖北海棠叶中根皮苷的含量测定［6］色谱条件:Diamonsil C18(250．0mm ×4．6mm，5μm)色谱柱;乙腈 －0．05% 磷酸水(25∶75)为流动相;检测波长为287nm;流速为:1．0ml/min;温度为30℃。(1)对照品溶液的制备:精密称取根皮苷对照品，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．015mg的溶液，备用。(2)供试品溶液的制备:精密移取湖北海棠叶提取液0．5ml于蒸发皿中于水浴上蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。线性关系的考察:精密移取根皮苷对照品溶液 2、4、6、8、10、12μl，依色谱条件进行测定，以根皮苷的含量(μg)为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，计算回归方程。(3)含量测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，外标一点法计算根皮苷含量。

4．湖北海棠叶中总黄酮的含量测定［6］:(1)对照品溶液的制备:精密称取根皮苷对照品适量，加入50%甲醇溶解制成每1ml含0．1mg的溶液，备用。供试品溶液的制备:精密移取湖北海棠叶提取液1ml蒸干，加50%甲醇溶解并定容至10ml量瓶中，0．45μm微孔滤膜滤过，即得。(2)检测波长的确定:分别取根皮苷对照品溶液和供试品溶液，按照紫外－可见分光光度法，空白试剂为50%甲醇，在选定的200～400nm波长范围内，分别对对照品溶液和供试品溶液进行全波长扫描。结果两者均在287nm有最大吸收，因此将检测波长定为287nm。

5．提取次数的考察:称取4份湖北海棠叶约10．0g，分别加入10倍量70%的乙醇，水浴中回流提取1、2、3、4次，每次1h，滤过，将各滤液分别合并。以湖北海棠叶中根皮苷及总黄酮的含量为评价指标筛选提取次数。

6．星点设计－效应面法优化提取工艺:采用星点设计－效应面法以回流提取法提取湖北海棠叶，以总黄酮及根皮苷的含量作为评价指标，对影响提取效果的主要因素乙醇浓度(X1)、溶剂用量(X2)、提取时间(X3)进行考察，从而确定回流提取的较佳工艺条件。

7．统计学方法:用SPSS 14．0统计软件，数据资料用效应面分析法及方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．湖北海棠叶中根皮苷线性范围的考察结果:以根皮苷的含量(μg)为横坐标，以测得的峰面积为纵坐标，计算回归方程为:Y=1745X+1．4467(R2=0.9999)，结果表明，根皮苷在 0．03 ～0．18μg的范围内线性关系良好。

2．湖北海棠叶中总黄酮的含量测定:(1)检测波长的确定:通过对对照品溶液和供试品溶液进行全波长扫描，结果两者均在287nm有最大吸收，因此将检测波长定为287nm。(2)线性关系考察:分别精密吸取根皮苷对照品溶液 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0ml并移至10ml量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，即得。按紫外－可见分光光度法，以50%甲醇为空白，在287nm波长处测定吸收度。吸收度(Y)为纵坐标，根皮苷的浓度(X)为横坐标，得回归方程为 Y=30.274X+0．0055，R2=0．9993。结果表明，对照品溶液在0．005～0．03mg/ml浓度范围内与吸收度呈现良好的线性关系。

3．提取次数的考察结果:以湖北海棠叶中根皮苷及总黄酮的含量为评价指标筛选提取次数，结果见表1。

表1 提取次数的考察(%)

结果表明，提取1次湖北海棠叶中总黄酮及根皮苷已基本提取完全，但为了避免试验中因误差造成总黄酮及根皮苷提取不完全，因此确定提取次数为2次。

4．星点设计－效应面法优化提取工艺［7］:(1)以乙醇浓度(X1)、溶剂用量(X2)、提取时间(X3)为自变量，以湖北海棠叶中根皮苷(W1)及总黄酮百分含量(W2)的综合评分为因变量，根据星点设计的原理，进行试验设计。因素水平见表2，试验设计及结果见表3。(2)模型拟合:采用 Design－Expert8．0．6软件，以根皮苷及总黄酮百分含量的综合评分对自变量进行回归和拟合，结果表明，r=0．9974，各项方差分析结果见表4，简化后的二项式方程为:Y=0．86+0.044X1－0．012X2+0．013X3－0．030X1X2+3．750 ×10－3X1X3+0.015X2X3－0.047X21+0.017X22+4．020 ×10－3X23，r=0．9956。说明 99．56% 总黄酮及根皮苷提取率的变差归因于3个因素的变化，即只有0．44%的变差不被此方程所解释。由表4的各个P值可以看出3个因素的线性效应都有较高的显著性(P＜0．01)。拟合回归方程的方差分析结果见表4。(3)工艺优化与预测:固定其中一个因素值，绘制其中两个因变量曲面图(图1～图3)。在图上选取较佳的工艺为:X1:68.88%，X2:8.54倍量，X3:148.2min。但考虑到实际的可操作性，修正工艺参数为乙醇浓度(X1):70%，溶剂用量(X2):8倍量，提取时间(X3):150min，并对其进行重复试验。称取湖北海棠叶50．0g，共3份，各加8倍量70%乙醇，提取2次，每次150min，平行制样。依法测定，结果见表5。结果表明，经优化后的工艺提取所得实测值与理论值接近，偏差在3%以内。因此可将该提取工艺修订为加入8倍量70%乙醇，提取2次，每次 150min。(4)验证试验:根据最优工艺提取湖北海棠叶3份(每份500g)，依法测定总黄酮及根皮苷的含量，结果见表6。

表2 湖北海棠中总黄酮提取工艺星点设计因素水平表

表3 星点试验设计与结果表

表4 拟合回归方程的方差分析结果

图1 乙醇浓度与提取时间对提取效果的影响

图2 乙醇浓度与溶剂倍量对提取效果的影响

图3 溶剂倍量与提取时间对提取效果的影响

表5 工艺优化结果表

表6 验证试验结果(%)

讨 论

近年研究表明，湖北海棠叶中主要含有茶多酚、黄酮、Zn、Cr、Mn等多种矿物质等，其中黄酮类以根皮苷含量高，且易于提取分离。文献［5～12］报道，湖北海棠叶中的总黄酮及根皮苷具有多种药理活性，因此以总黄酮及根皮苷的含量作为湖北海棠叶提取工艺的评价指标，具有一定的科学性。

本试验通过星点设计－效应面法优选所得的最佳提取工艺为加入8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次。与笔者前期通过正交试验优选的结果稍有差异［5］(8倍量70%的乙醇，回流提取3次，每次1h)。为了验证提取工艺的可行性，实验中分别采用优选的两种工艺条件进行提取，并进行总黄酮及根皮苷的含量测定比较，结果两种工艺提取出的总黄酮及根皮苷含量接近，8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次1h所得总黄酮及根皮苷含量较8倍量70%乙醇回流提取150min，提取2次的分别高3．2%和2.4%。关于大生产中工艺条件的选择有待于通过总黄酮与根皮苷的提取率及生产成本进行综合评价选择。

1 方志先，廖朝林．湖北恩施药用植物志［M］．武汉:湖北科学技术出版社，2006:446－447

2 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志［M］．北京:科学出版社，1974:379－380

3 朱靖静，刘呈雄．湖北海棠质量标准研究［J］．中药材，2010;33(5):707－710

4 冯天艳，方荣，邓改改，等．根皮苷对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用［J］．中药药理临床，2010，26(5):47－49

5 王幸，师延琼，覃鸿恩，等．多指标综合评价法优选湖北海棠叶中总黄酮提取工艺［J］．中国实验方剂学杂志，2012，18(13):46－49

6 李瑾．太白楤木保肝活性部位的制备及其制剂前研究［D］．西安:陕西中医学院，2012

7 冯天艳，汪鋆植，周继刚，等．湖北海棠叶总黄酮抗CCl4所致大鼠肝纤维化作用研究［J］．中药药理与临床，2012，28(2):71－74

8 杜幼芹，冯天艳，邓改改，等．湖北海棠叶总黄酮对日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的抑制作用［J］．中国血吸虫病防治杂志，2011，23(5):551－554

9 冯天艳，方荣，邓改改，等．根皮苷对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用［J］．中药药理临床，2010，26(5):47－49

10 Jun ZW，Mi HC，BingJie X，et al．Estrogenic and Ant－iestrogenic acitivities of phloridzin［J］．Biol Pharm Bull，2010，33(4):592 －597

11 曹丹，薛冰洁，黄文峰，等．湖北海棠总黄酮对去势大鼠骨质疏松的影响［J］．中药药理与临床，2011，27(5):56－59

12 薛冰洁，曹丹，周继刚，等．湖北海棠总黄酮对成骨细胞增殖分化及破骨细胞活性的影响［J］．中国中医骨伤科杂志，2011，19(5):12－14