叶酸缺乏的鼠胚成纤维细胞诱导为iPS细胞的实验研究＊

闫秋月， 邱占东， 胡文涛， 方 瑜， 李 婧， 陈 勤， 张苏明

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科，武汉 430030

2006 年，诱导多潜能干（induced pluripotent stem，iPS）细胞［1］的获得为再生医学的发展开辟了新的道路。iPS细胞不仅具备胚胎干细胞自我更新和多向分化的特性，而且避开了胚胎干细胞在应用过程中所存在的伦理学和免疫原性问题，在疾病模型，药物筛选，探索疾病机制，及将来的细胞治疗方面具有广泛的应用前景。然而iPS细胞自身也存在诱导效率低和致癌性两大应用瓶颈，且致癌性的主要原因在于病毒载体和癌基因（c－Myc）的应用。经过近几年的研究，虽然iPS细胞诱导体系经4因子到3 因子（Klf4＋Oct4＋Sox2）［2］、2 因子（Oct4＋Sox2［3］，Oct4＋Klf4［4］），再到单因子（Oct4）［5］的改变，产生肿瘤几率在下降，但诱导效率也随之明显降低。因此如何在不降低诱导效率的前提下，降低致癌性成为研究者急需解决的问题。

多个研究表明，DNA 甲基化参与细胞重编程的过程，DNA 去甲基化促进iPS细胞的诱导［6］。而叶酸作为一种B 族维生素，通过一碳单位参与细胞的甲基化过程，叶酸缺乏可引起基因组去甲基化［7］，故本研究运用无叶酸培养条件对鼠胚成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）进行干预，联合3因子（Klf4＋Oct4＋Sox2）诱导iPS细胞，探索一种相对安全的iPS细胞诱导体系。

1 材料与方法

1.1 材料

昆明种孕鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。pMXs－IRES－Sox2，pMXs－IRES－Klf4，pMXs－IRES－Oct4购自Addgene公司。质粒提取试剂盒购自Omega公司。Lipofectamine 2000 购自Invitrogen 公司。DMEM 高糖培养液，DMEM／F12培养液，无叶酸基础培养液购自Hyclone公司。LIF 因子，SSEA－1，Oct4和AP染色试剂均购自Chemicon公司。

1.2 方法

1.2.1 MEF 的原代培养 将孕12.5d 昆明种孕鼠断颈处死，无菌下取出胚鼠，分离皮肤组织，剪碎，0.25%胰酶消化分离细胞，离心后用普通培养液（DMEM／F12培养液和10%胎牛血清，2%青／链霉素）重悬细胞，接种于含普通培养液的培养瓶中37℃恒温培养箱培养。第2天根据细胞密度对其进行换液或传代培养。将第1代和第2代MEF 进行冻存备用。

1.2.2 病毒颗粒的包装 参照文献［8］的方法进行逆转录病毒颗粒的包装。根据质粒提取试剂盒的说明书步骤提取3种分别含Oct4，Sox2和Klf4因子的逆转录病毒载体质粒。然后根据Lipofectamine 2000脂质体转染法转染PLAT－E 细胞进行病毒包装，获得病毒液。同时以绿色荧光蛋白（GFP）作为平行对照观察转染效率。

1.2.3 MEF的无叶酸培养及iPS细胞的诱导 复苏第1或2代MEF，用无叶酸培养液（无叶酸基础培养液和10%胎牛血清，2%青／链霉素）进行培养，每天换液，培养3d后按3×104个细胞／孔的密度接种到6孔板中，用无抗培养液（DMEM 高糖溶液和10%胎牛血清）培养6h，细胞融合度达约30%左右进行病毒感染18h，无抗培养液孵育6h后重复感染1次。然后换鼠胚胎干细胞培养液（DMEM 高糖培养液，15%胎牛血清，1%L－谷氨酰胺，1%β－巯基乙醇，1%非必需氨基酸，1%青／链霉素，1‰10μg／mL LIF）培养，每天换液至克隆出现，进行传代及鉴定。

1.2.4 iPS细胞的鉴定 iPS细胞AKP染色，根据AKP染色试剂盒说明步骤，将iPS细胞用4%多聚甲醛固定15min，然后加染色混合液孵育20min，PBS漂洗后观察。诱导得到的iPS细胞用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗5min，洗3次；0.2% TritonX－100破膜10min；羊血清封闭30min；分别用SSEA－1抗体和Oct4一抗4℃孵育过夜，第2天用PBS洗3次，每次5min，然后加二抗TRITC－羊抗鼠IgG室温孵育1h。PBS洗后甘油封片，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 病毒颗粒的包装

脂质体转染法转染PLAT－E 细胞进行病毒包装，转染后48h 平行对照组GFP 的转染效率为80%～90%，结果如图1所示。

图1 PLAT－E细胞转染后48h 光镜下形态（A）和荧光显微镜下GFP表达（B）（×100）Fig.1 The morphology（A）and GFP expression（B）of PLAT－E cells 48hafter transfection（×100）

2.2 iPS细胞的诱导及鉴定

MEF无叶酸培养3d后（图2A）进行iPS细胞的诱导，24d后出现iPS 细胞克隆，诱导效率约为（0.010±0.005）%，形态如图2B 所示，之后对其进行AKP染色，Oct4，SSEA－1免疫荧光染色鉴定，结果均成阳性（图2C～G）。

3 讨论

本研究在无叶酸培养条件下，利用3因子成功地将MEF诱导为iPS 细胞，且诱导效率不低于经典4因子体系，约为（0.010±0.005）%，故在不降低诱导效率的前提下降低了iPS细胞的致癌性。

虽然研究者已利用多种靶细胞［8－10］，多种诱导体系［2－5］成功地诱导出iPS细胞，但往往在提高诱导效率的同时增加了致癌性，或在降低致癌性的同时也降低了诱导效率，至今未能很好地解决这两大问题。

细胞重编程过程与表观遗传学的改变密切相关。Bhutani等［11］研究表明细胞重编程过程依赖于DNA 去甲基化，多能性基因启动子区的去甲基化可使多能性基因高表达，进而促进和完成终末细胞向多能性细胞的转化。近来研究亦表明一些小分子化合物［12］可通过抑制DNA 甲基化提高iPS细胞的诱导效率，或替代部分转录因子完成iPS细胞的诱导。但目前人们对小分子化合物的研究十分有限，仍需探索新的代替外源性转录因子的方法以降低iPS细胞的致癌性，优化诱导体系。故本研究则探索叶酸在iPS细胞诱导过程中的作用。

叶酸属于B族维生素的一员，通过以四氢叶酸的形式转化为S－腺苷甲硫氨酸（SAM），参与DNA甲基化的过程。叶酸缺乏时，SAM 很快处于耗竭状态，而SAM 作为DNA 甲基化作用最重要的甲基提供者，一旦缺乏则会引起DNA 基因组的去甲基化，故叶酸缺乏可引起DNA 去甲基化。且本研究亦表明对靶细胞进行无叶酸处理，可以替代癌基因c－Myc的使用，诱导出相对安全的iPS细胞。但其中的具体机制尚不清楚，我们将在后续的实验中对其进行进一步的研究。

图2 MEF感染前（A）和iPS细胞（B）的形态，及iPS细胞的AKP（C）、SSEA－1（D、E）和Oct4（F、G）染色鉴定（×100）Fig.2 The morphologies of MEF（A）and iPS cells（B）and the identification of iPS cells by staining for AKP（C），SSEA－1（D，E）and Oct4（F，G）（×100）

总之，本研究获得了一种新的相对安全的iPS细胞诱导体系，为将来获得无外源性转录因子参与的诱导体系，获得安全可实现临床应用的iPS细胞奠定了基础。

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