脓毒症大鼠早期ET－1、NO、E－选择素的表达及米力农对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用

徐 盈， 陈国兵， 苏 洁， 钟 玲， 吴海燕， 施湘平， 吴燕萍

云南省第一人民医院，昆明医学院附属昆华医院急诊ICU，昆明 650032

心肌损伤是脓毒症病死率显著增加的重要原因，约占30%～80%［1］。脓毒症心肌损伤的机制已经形成一定共识，普遍认为有多种机制参与致病，循环中的心肌抑制因子包括肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白细胞介素1、6（interleukin－1、6，IL－1、6）、内皮素－1（endothelin－1，ET－1）等，可以直接抑制心肌收缩；线粒体功能不全和心肌细胞凋亡也是脓毒症心肌损伤的重要机制；此外心肌能量代谢异常、钙离子代谢异常等均参与了这一病理生理过程［2］。因此早期联合运用药物治疗在脓毒血症器官保护中一直备受关注；米力农因其正性肌力及扩张血管的作用广泛用于治疗临床各类病因所导致的急慢性心衰，实验中采用复制脓毒症模型，观察脓毒症大鼠血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）、心肌同工酶CK－MB、E－选择素（E－selectin）及心肌匀浆肿瘤坏死因子－α、内皮素－1、一氧化氮（nitric oxide，NO）的改变及米力农对其的干预作用，旨在进一步研究不同剂量米力农对脓毒症大鼠早期血管内皮细胞及心肌细胞的保护作用，并观察其对心肌TNF－α，ET－1、NO 和血清E－选择素的影响，探讨米力农对脓毒症心肌保护的药理作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及脓毒症模型制备

日龄70～95d的雄性SD 大鼠60只（购自昆明医学院动物实验中心），体重300～400g，平均（355.32±23.05）g，按随机数字表法分为5组，每组12只。大鼠实验前禁食12h，自由饮水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，沿中下腹正中线切口2 cm，暴露腹腔脏器，探查并将盲肠提出，7号丝线距盲肠根部1.5cm，血管弓内结扎盲肠，采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型。正常对照组不予任何处置；假手术组及模型组于制模后经尾静脉注射4mL生理盐水，12h后重复给药；米力农小剂量组和大剂量组均于CLP 制模后经大鼠尾静脉分别给予米力农0.25μg／kg及0.5μg／kg（0.9%生理盐水稀释为10mL，1 min内给药完毕），12h后重复给药（米力农由山东鲁南制药有限公司生产）。本实验符合动物伦理学标准。

1.2 检测指标及方法

制模后24h经腹主动脉采血3 mL，离心后取上清液－70℃保存。取血后处死大鼠，取左心室心尖部心肌组织分别用多聚甲醛水溶液和戊二醛固定，苏木精－伊红（HE）染色光镜观察及醋酸铀－枸盐酸铅双染行电镜观察心肌组织病理学改变；余心肌组织匀浆后取上清液，－70℃储存备用。采用同相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测TNF－α（试剂盒由上海信然生物技术有限公司提供）；用放射免疫法测定ET－1（试剂盒购自上海研域化学试剂有限公司）；一氧化氮（NO）化学性质活泼，在体内代谢很快转为NO2－和NO3－，而NO2－又进一步转化为NO3－，利用硝酸还原酶特异性将NO3－还原为NO2－，通过显示深浅测定其浓度的高低（化学检测试剂盒由南京生物技术有限公司提供）；大鼠血清E－选择素检测采用双抗体夹心酶标免疫分析法（试剂盒USCNLIFE由武汉华美生物工程有限公司提供）；采用ELISA 法测定血清CK－MB及cTnI浓度（试剂盒购自美国雅培公司）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 实验的一般情况

预实验取12 只大鼠复制脓毒症模型，死亡4只，剩余大鼠分别于制模后6、12、18、24h各处死2只，取心肌组织制作病理切片，观察心肌病理改变。结果发现盲肠结扎穿孔术（CLP）后24h心肌细胞出现明显间质水肿，结构排列疏松等显著病理变化，所以本研究选择24h为实验观察时间点。

2.2 取各组血清cTnI、CK－MB、NO、ET－1、E－选择素比较

正常对照组与假手术组血清检测cTnI、CK－MB、NO、ET－1、E－选择素比较差异无统计学意义；模型组cTnI、CK－MB、NO、ET－1、E－选择素水平较正常对照组及假手术组均明显升高（均P＜0.01）；米力农小剂量组cTnI、CK－MB、NO、ET－1、E－选择素浓度和模型组比较无明显差异（P＞0.05）；米力农大剂量组cTnI、CK－MB、NO、ET－1、E－选择素浓度较模型组及米力农小剂量组明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组脓毒症大鼠血清cTnI、CK－MB、ET－1、NO、E－选择素水平比较（±s，n＝12）Table 1 Comparison of serum level of cTnI，CK－MB，ET－1，NO and E－selectin in each group（±s，n＝12）

表1 各组脓毒症大鼠血清cTnI、CK－MB、ET－1、NO、E－选择素水平比较（±s，n＝12）Table 1 Comparison of serum level of cTnI，CK－MB，ET－1，NO and E－selectin in each group（±s，n＝12）

与正常对照组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别CK－MB（ng／mL）cTnI（ng／mL）NO（μg／mL）ET－1（pg／mL）E－选择素（ng／mL）1.35 0.052±0.016假手术组370.50±22.95 1.327±0.012 63.00±2.09 42.86±0.71 0.229±0.012模型组1497.50±562.56＊9.425±0.637＊122.09±7.33＊145.92±5.90＊5.130±0.667＊米力农小剂量组1398.52±511.52＊5.572±0.398＊92.75±6.97＊146.52±5.71＊4.115±0.668＊米力农大剂量组620.00±56.49＊△2.520±0.267＊△61.83±5.36△87.42±6.19△2.130±0.519正常对照组223.67±21.92 0.210±0.015 60.72±2.37 45.12±＊△

2.3 各组心肌组织病理学改变

正常对照组、假手术组大鼠心肌组织病理学改变未见明显异常，肌纤维排列紧密整齐，线粒体结构清晰；模型组心肌纤维结构排列疏松紊乱、肌丝断裂、溶解严重，肌质网高度肿胀，线粒体肿胀聚集、嵴结构模糊，出现带状空泡化改变，间质充血水肿，细胞核肿胀；米力农小剂量组心肌病变较模型组无明显减轻；米力农大剂量组较模型组心肌病变减轻，心肌轻度肿胀，肌丝结构排列尚规则，线粒体无明显肿胀，部分线粒体空泡化。图1为各组大鼠心肌组织HE染色图片。

图1 脓毒症大鼠各组心肌组织病理学改变（HE染色，×200）Fig.1 Pathological changes of myocardial tissues of sepsis rats in different groups（HE staining，×200）

2.4 各组心肌匀浆TNF－α、ET－1、NO、NO／ET－1水平比较

正常组及假手术组心肌组织TNF－α、ET－1、NO、NO／ET－1水平差异无统计学意义。模型组心肌组织TNF－α、ET－1、NO 水平较正常对照组及假手术组明显升高（均P＜0.01），NO／ET－1水平降低（P＜0.01）；米力农小剂量组心肌组织TNF－α、ET－1、NO、NO／ET－1水平较模型组无明显改变；米力农大剂量组心肌组织TNF－α、ET－1、NO 水平较模型组明显下降（均P＜0.01），但较正常对照组及假手术组仍升高（均P＜0.01）；米力农小剂量组和大剂量组NO／ET－1值与模型组水平比较变化不明显，但较正常组和假手术组明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组脓毒症大鼠心肌匀浆TNF－α、NO、ET－1、心肌匀浆NO／ET－1比值水平（±s，n＝12）Table 2 The level of TNF－α，NO，ET－1and the ratio of NO／ET（±s，n＝12）

表2 各组脓毒症大鼠心肌匀浆TNF－α、NO、ET－1、心肌匀浆NO／ET－1比值水平（±s，n＝12）Table 2 The level of TNF－α，NO，ET－1and the ratio of NO／ET（±s，n＝12）

与正常对照组比较，＊P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别TNF－α（pg／g）NO（μg／g）ET－1（ng／g）NO／ET－1正常对照组239.63±37.21 22.02±1.13 1.52±0.07 14.59±0.97假手术组294.00±34.51 23.17±1.53 1.67±0.10 13.95±0.95模型组956.70±72.61＊101.66±6.89＊16.32±0.43＊6.57±0.35＊米力农小剂量组912.50±96.67＊93.72±4.63＊15.12±0.56＊6.12±0.31＊米力农大剂量组442.53±75.67＊△55.61±5.12＊△9.21±0.42＊△6.02±0.54＊

3 讨论

脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，创伤导致的脓毒症和多脏器功能衰竭在重症监护病房（ICU）内的病死率为60%［3－4］。本研究采用大鼠盲肠结扎加穿孔法复制脓毒症模型，通过盲肠的结扎和穿孔，使有菌的肠内容物污染腹腔造成弥漫性腹膜炎，诱发广泛的全身性炎性反应，动物表现出与临床相似的早期高动力循环、高代谢和晚期低动力循环状态，观察脓毒症早期内皮素－1、NO、血清E－选择素表达和血管内皮细胞及心肌细胞损害及其药物干预的相关性。

血管内皮细胞（endothelial cells，EC）释放活性物质如一氧化氮（NO）、前列腺环素（PGI）等血管扩张物质及内皮素（ET－1）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）等血管收缩物质；NO、细胞间粘附因子（ICAM－1）、血管粘附分子（vascular adhesion molecule－1，VCAM－1）、E－选择素（E－selectin）等炎症调节因子；内皮细胞参与白细胞的粘附和激活，与脓毒症时发生的微循环障碍和毛细血管通透性增高密切相关。选择素家族如E－选择素可促使白细胞沿血管内皮滚动，细胞黏附因子（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）可以稳定白细胞与内皮细胞的黏附［5－6］。在炎性介质刺激下，EC 可表达多种粘附分子，其中E－选择素是选择素家族中唯一表达于EC 的成员，随着E－选择素的表达增加，其通过与白细胞表面的葡萄糖蛋白结合，使血管内快速流动的白细胞运动减慢并与内皮细胞产生黏附，EC 在受到炎症介质激活后6h即可增加E－选择素合成，以可溶性E－选择素存在，是观察EC早期活化很好的指标［7］，可溶性E－选择素水平持续升高的患者往往死亡率高［8］；检测E选择素可作为判断脓毒症预后的指标之一。

NO 是内皮细胞产生的主要血管舒张物质，脓毒症时炎症细胞与血管内皮细胞相互作用造成内皮细胞损伤，诱生型一氧化氮合酶（iNOS）大量表达，体内NO 水平呈指数级增加，高浓度的NO 作用于巯基引起蛋白质、核酸等所含巯基发生硝化反应，引起脂质过氧化反应，产生破坏作用［9］。实验中，血清NO 和心肌组织匀浆NO 在CLP术后升高，提示内皮细胞在细菌、毒素和炎性介质的诱导下过度产生NO 和ET，引起血管痉挛收缩，造成心肌细胞的缺血缺氧性损伤。TNF－α是炎症反应的重要启动因子，通过花生四烯酸代谢途径、氧自由基、一氧化氮（NO）等各种细胞毒性基因转录、ADP 核糖基化、DNA 片段等多种途径造成心肌损伤［10］。内皮素（ET）主要表达于内皮细胞，但心肌细胞、肾小管上皮细胞等也能合成，具有强烈而持久的收缩血管平滑肌作用，引起全身各种血管，尤其是冠状动脉的强烈收缩。ET 家族中有3 种异构体，即ET－1、ET－2、ET－3，其中ET－1主要表达于内皮细胞［11］。本实验中，CLP 术后模型组血清和心肌匀浆中ET－1即升高，在24h时点水平略有下降［血清ET－1（145.92±5.90）pg／mL，心肌匀浆ET－1（16.32±0.43）ng／g）］，仍处于较高水平，显著高于正常组与假手术组（P＜0.01），变化具有相同趋势。NO 随时间推移显著升高，导致组织和血清中NO 和ET－1平衡失调，比值逐渐下降，显著低于正常比值（P＜0.01），提示内皮细胞在受到炎性介质刺激后高表达内皮素，与NO 平衡失调，并随脓毒症的发展有逐渐加剧表现。本研究结果，模型组心肌ET－1、TNF－α、NO、E－选择素水平明显升高；小剂量米力农治疗后心肌ET－1、TNF－α、NO、E－选择素水平较模型组无明显降低，大剂量组ET－1、TNF－α、NO、E－选择素水平较模型组显著降低，表明大剂量米力农治疗能减轻ET－1、TNF－α、NO、E－选择素对血管内皮细胞和心肌组织的损伤作用。

心肌酶谱检测对脓毒症早期心肌损伤的诊断具有重要的意义，CK－MB在评判心肌损伤上有较好的灵敏度，美国和欧洲心脏病协会把CK－MB 和cTnI联合检测作为心肌梗死和心肌缺血的确诊标准［12－13］。Chopra等［14］研究报道cTnI升高与脓毒症的病程进展及严重程度相关，脓毒症晚期甚至7d后仍有cTnI持续升高。本实验中米力农大剂量组CK－MB、cTnI升高程度较模型组明显降低，心肌病理改变较模型组比较得到改善，提示大剂量米力农对脓毒症心肌损伤具有保护作用；而米力农小剂量组血清CK－MB、cTnI及心肌病理改变与模型组无明显差异，结果表明小剂量米力农对脓毒症心肌损伤无保护作用。

米力农是美国Sterling公司开发的高效、低毒的二代双吡啶酮类强心剂，属于非洋地黄类、非儿茶酚胺类正性肌力药物；米力农注射液为磷酸二酯酶抑制剂（phosphodiesteras，PDEs），其与心肌磷酸二酯酶111的酯化部分结合，抑制磷酸二酯酶111对cAMP降解，内环磷酸腺苷（cAMP）浓度升高，增加Ca2＋内流，产生正性肌力作用，并通过增高血管平滑肌细胞内cAMP含量而具有扩血管作用，米力农的强心作用对心功能的维持具有重要意义［15］。米力农还具有减少脓毒症炎性因子表达的作用［16］。PDEs抑制剂被视作强效血管扩张剂和兼有抗血小板活性的药物而用于治疗心衰，近年来，PDEs作为新的治疗靶点，引起众多学者关注，被认为是作用于细胞内作用靶点的新的抗炎药物和中枢神经系统药物，并且PDEs可抑制多种炎症介质／细胞因子的释放，抑制TH2 细胞IL－4，IL－5基因的表达；抑制白细胞的激活（呼吸爆发）及白细胞游走；并抑制白细胞黏附因子（Leulcocyte adhesion molecule，CAM）的表达或上调，诱导IL－6，诱导细胞凋亡，刺激内源性激素和儿茶酚胺类物质的释放［17］。本实验从单核／巨噬细胞激活及内皮细胞损伤来启动炎症反应的角度观察到脓毒症时存在心肌损伤，伴有心肌TNF－α、ET－1、NO 水平升高及NO／ET－1降低。结果显示，小剂量米力农治疗（0.25μg／kg）对心肌局部TNF－α、ET－1、NO 及NO／ET－1 水平无明显干扰，而大剂量米力农（0.5μg／kg）治疗能明显降低心肌匀浆TNF－α、ET－1、NO 水平，为临床治疗脓毒症早期应用PDEs以减轻心肌损伤提供了实验根据。

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