训练强度与大鼠心肌组织及线粒体损伤的关系＊

蒋 磊， 周振茂， 夏美燕， 王佳佳， 杜世全△

安徽医科大学1体育教学部2药理教研室，合肥 230032

一定强度的运动可作为一种外在刺激对机体产生一系列影响，特别是对心脏往往有着“双向”作用。目前认为，适宜强度的有氧运动可对心脏产生正面效果，如心肌供氧改善、肌纤维增粗、小血管扩大、心肌收缩力增强、血液中脂质代谢改善等［1］。但长期过度训练或力竭性运动则会对心脏产生负面影响，对心肌造成不同程度的损伤，如心肌细胞凋亡增加、供血供氧不足、心肌结构受损等，进而影响心脏机能，形成常见的运动性疾病，严重的可导致猝死，其发生可能由多方面因素造成［2］。

本研究利用不同运动训练强度的大鼠动物模型，对标志其心肌损伤的血清学指标、组织氧化及心肌线粒体过氧化指标进行检测，以期从氧化应激的角度探讨运动训练强度与心肌损伤的关系，旨在为进一步揭示运动训练导致心肌损伤的机制提供一定的科学实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD 大鼠30只，购自安徽医科大学实验动物中心，体重在180～220g之间，常规喂养，环境温度控制在（25±2）℃，相对湿度在（60±15）%，自由进食。大鼠随机分为3组：正常对照组（normal control group，C）；一般有氧训练组（aerobic exercise group，A）；力竭性过度训练组（overtraining group，O），每组10只。

1.2 实验动物模型的建立

参照胡亚哲等［3］报道的方法造模。C 组常规饲养，不进行训练。A 组和O 组分别适应性喂养1d，然后开始游泳训练。首次训练两组均游5 min，每天增加游泳的时间，至第3 周末，A 组游泳时间为75min／d，O 组游泳时间为180min／d。从第4周开始，A 组大鼠训练保持不变，O 组大鼠训练时间虽然不变，但开始尾部负重（重物为体重的5%），第1天在最后5min开始负重，而后每周增加10min，直至全程负重。大鼠训练时如有在水下10s不能浮出的力竭表现时，立刻捞出水面休息5min，然后继续训练达到规定时间。A 组和O 组大鼠总训练时间为16周。O 组大鼠在实验过程中有2只死亡，故取8只为有效数据。

1.3 选取检测样本

造模期间记录大鼠的精神状态、体重变化、运动能力变化和皮毛光洁等情况，3组大鼠于末次训练后，立刻处死取标本，采用腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg／kg）方法，对大鼠进行麻醉，仰卧固定，于腹部正中剪开皮肤，分离腹主动脉，采集血液，常温静置30 min，3 000r／min离心15min，上清液－70℃保存。打开胸腔，迅速剪取各组大鼠同一部位心肌组织（0.8g）于冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干，用冷生理盐水制备成10%心肌组织匀浆液，－70℃保存备用。另取同一部位心肌组织（0.8g），于冰浴中剪碎并匀浆，根据Vaghy等［4］所报道的方法在4℃下以差速离心法分离线粒体。

1.4 指标检测及其方法

采用全自动生化分析仪（日立7170）检测各组大鼠血磷酸肌酸激酶（CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK－MB）水平；采用化学比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）水平；采用双抗体夹心ABC－ELISA 法测定大鼠血清心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）的含量。

心肌组织匀浆液于4℃，2 000r／min 离心10 min，上清液用于丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、过氧化氢酶（CAT）活性的测定。MDA、SOD、CAT 和GSH－Px 检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品，检测操作严格按试剂盒要求进行。

心肌线粒体中MDA、SOD 测定方法同心肌组织，均按试剂盒要求进行操作。线粒体游离钙的测定方法为：用负载介质制成心肌线粒体悬浮液，使其浓度适度后，加入Ca2＋荧光指示剂Fura－2／AM，37℃水浴振荡45min，离心，弃上清后加入1mL 负载介质，37℃水浴2～3min，用960MC 荧光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）测定荧光信号，方法是单波长荧光法，激发波长为340nm，发射波长为448nm，根据Lukacs等［5］报道的方法，利用测得的荧光信号和蛋白浓度计算线粒体内游离钙的浓度。所有测定在40min内完成。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况观察

正常对照组和一般有氧训练组大鼠活动正常，皮毛光滑整齐，对声音和光刺激反应灵敏，精神状态良好，无异常状况，体重增加，但未表现出统计学差异；力竭过度训练组大鼠精神普遍倦怠，对外界声音刺激和光刺激反应淡漠，皮毛脱落不光洁，体型偏瘦弱，眼神暗淡无光，负重训练2周后，体重增加明显减慢，第4周起体重较对照组和一般有氧训练组大鼠显著下降。表1示各组大鼠的体重改变情况。

表1 不同程度训练大鼠体重变化（g，±s）Table 1 The weight changes in rats undertaking exercises with varying intensities（g，±s）

表1 不同程度训练大鼠体重变化（g，±s）Table 1 The weight changes in rats undertaking exercises with varying intensities（g，±s）

与一般有氧训练组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；与正常对照组比较，＃P＜0.05＃＃P＜0.01

组别n训练时间2周4周8周16周10 242±17 343±22 399±21 433±20一般有氧训练组10 251±23 362±19 442±28 498±24力竭过度训练组8 237±19 263±24＊ ＃ 257±19＊＊ ＃＃ 298±25＊＊＃＃正常对照组

2.2 血清CK、CK－MB、LDH、cTnⅠ含量的测定

CK、CK－MB、LDH、cTnⅠ是一系列心肌损伤血清标记物。由表2所示，力竭过度训练组大鼠血清CK、CK－MB、LDH、cTnⅠ各项指标相比正常对照组和一般有氧训练组都有显著的提高，说明过度训练能明显提高大鼠血清心肌酶谱指标水平；但相比正常对照组，一般有氧训练组各项指标无明显差异，尚不能认为一般训练能提高大鼠血清中心肌酶谱指标水平。

表2 不同程度训练大鼠血清CK、CK－MB、LDH、cTnⅠ的变化（±s）Table 2 Levels of serum CK，CK－MB，LDH and cTnⅠin different groups（±s）

表2 不同程度训练大鼠血清CK、CK－MB、LDH、cTnⅠ的变化（±s）Table 2 Levels of serum CK，CK－MB，LDH and cTnⅠin different groups（±s）

与一般有氧训练组比较，＊P＜0.05＊＊P＜0.01；与正常对照组比较，＃＃P＜0.01

组别n CK（U／L）CK－MB（U／L）LDH（U／L）cTnⅠ（ng／mL）.046±0.022一般有氧训练组10 299.11±72.14 435.74±94.25 1 013.73±101.98 0.064±0.019力竭过度训练组8 465.42±95.45＊＃＃625.75±83.21＊＃＃ 1 494.98±103.75＊＃＃0.563±0.189＊＊＃＃正常对照组10 262.65±29.93 360.65±68.82 971.30±73.98 0

2.3 心肌组织抗氧化能力测定

由表3所示，不同强度的训练对实验大鼠心肌细胞中多种抗氧化自由基的酶类活性及脂质过氧化产物的生成具有显著影响。力竭过度训练组大鼠与正常对照组和一般有氧训练组相比，心肌中MDA含量显著增加，而SOD、GSH－Px活性均显著性降低（P＜0.05或P＜0.01），而CAT 活性差异无统计学意义。一般有氧训练组与正常对照组相比，SOD、GSH－Px活性虽有提高，MDA 含量及CAT 活性略有下降，但差异均无统计学意义。

表3 不同程度训练大鼠心肌组织抗氧化能力测定结果（±s）Table 3 Antioxidant capacity of cardiac muscle tissues of rats undertaking exercises with different intensities（±s）

表3 不同程度训练大鼠心肌组织抗氧化能力测定结果（±s）Table 3 Antioxidant capacity of cardiac muscle tissues of rats undertaking exercises with different intensities（±s）

与一般有氧训练组比较，＊P＜0.05；与正常对照组比较，＃＃P＜0.01

组别n MDA（nmol／mgprot）SOD（U／mgprot）GSH－Px（U／mgprot）CAT（U／mgprot）±1.58一般有氧训练组10 0.84±0.24 562.49±59.52 175.83±29.25 8.39±1.92力竭过度训练组8 1.82±0.25＊＃＃396.82±43.39＊＃＃89.30±18.81＊＃＃正常对照组10 0.92±0.21 545.34±69.45 146.35±24.23 8.45 6.41±2.17

2.4 心肌线粒体MDA、SOD、游离钙含量测定

由表4所示，与正常对照组和一般有氧训练组相比，力竭过度训练组大鼠心肌线粒体MDA 含量显著升高（P ＜0.01），SOD 活性显著下降（P ＜0.01），同时造成大鼠心肌线粒体游离钙浓度显著下降（P＜0.01）。

表4 不同程度训练大鼠心肌线粒体MDA、SOD、游离钙含量（±s）Table 4 MDA level，SOD activity and free Ca2＋concentration in myocardial mitochondria in different groups（±s）

表4 不同程度训练大鼠心肌线粒体MDA、SOD、游离钙含量（±s）Table 4 MDA level，SOD activity and free Ca2＋concentration in myocardial mitochondria in different groups（±s）

与一般有氧训练组比较，＊＊P＜0.01；与正常对照组比较，＃P＜0.05＃＃P＜0.01

组别n MDA（μmol／g）SOD（U／mg）游离钙（nmol／L）10 15.22±3.50 17.72±2.47 307.64±31.45一般有氧训练组10 19.73±4.08＃19.69±3.89＃294.90±29.45力竭过度训练组8 30.23±5.12＊＊＃＃10.39±2.18＊＊＃＃223.28±29.66＊＊＃＃正常对照组

3 讨论

科学系统的训练可使心脏的形态结构产生良好的适应性改变，然而，长期过度训练则会造成不同程度的损伤，甚至发生病理性改变。研究发现，过度训练的大鼠心肌可发生纤维化、结缔组织增生、心肌细胞线粒体肿胀、部分线粒体腔内出现絮状致密物等表现［3］。本实验采用游泳运动建立动物模型研究过度训练对心脏的损伤作用。研究发现，实验第4周起，过度训练组大鼠体重持续下降，失重甚至超过正常体重的1／3，这可能与过度训练时引起的交感神经兴奋性增强、机体能源物质消耗增大、食欲不佳、睡眠障碍等因素有关。

心肌细胞内存在大量参与能量代谢的酶，近几年，临床上常通过检测CK－MB、CK、LDH 等指标含量来评价心肌病变损伤程度［6］。研究发现［7］，过度训练大鼠的心肌局部CK、LDH 活性显著降低，提示心肌中有氧和无氧供能系统及心肌细胞膜受到严重破坏，细胞糖代谢和氧化磷酸化能力均减弱，最终导致心肌损伤。心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），只存在于心肌收缩蛋白细肌丝上，具有高度的心肌特异性［8］。正常情况下，cTnⅠ无法通过细胞膜释放入血，血液中难以检测到。当心肌细胞受损时，cTnⅠ快速释放入血液，血清值呈几十到几百倍上升，释放量与心肌损伤程度呈正相关［9］。因此，在轻度心肌损伤时cTnⅠ比传统的心肌酶更为敏感，检测血清cTnⅠ已成为诊断心肌损伤的金标准［10］。本实验结果显示，竭力过度训练组大鼠血清CK、CK－MB、LDH 和cTnⅠ水平比正常对照组和一般有氧训练组有显著提高，提示过度训练可能导致心肌细胞受损，细胞膜通透性增大，从而导致胞内CK、CK－MB、LDH 和cTnⅠ进入血液的量增加。

丙二醛（MDA）是反映氧自由基生成及细胞内脂质过氧化程度的敏感指标。本研究中，过度训练大鼠的心肌细胞及线粒体中MDA 含量均显著升高，提示过度训练使大鼠心肌组织中氧化应激反应加剧。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内最主要的抗氧化自由基的酶，其活性是衡量机体抗氧化自由基能力的重要指标。研究发现，长时间大强度运动会明显增加体内活性氧生成，可见氧自由基系统与运动间的关系十分密切，大量氧自由基生成可导致运动性疲劳及运动损伤［11］。本研究发现，一般有氧运动训练可使心肌SOD 活性轻度升高，心肌清除氧自由基能力有所增强，但过度负荷训练则导致SOD 活性显著下降，使得心肌细胞清除氧自由基的能力明显降低，从而使细胞膜严重受损。GSH－Px与CAT均为机体内清除H2O2的酶，本研究发现，力竭运动组中GSH－Px活性较CAT 活性降低更为显著，这可能是因为这两种酶在生物活性上具有差异，由运动产生的H2O2的清除主要是由GSH－Px发挥抗氧化作用的［12］，而力竭运动大鼠的心肌中GSH－Px活性降低，表明清除H2O2的能力显著下降。钙稳态失调是线粒体损伤的重要原因之一，心肌细胞的不可逆变化也常与Ca2＋在各细胞结构中的分布异常有着密切关系。已有报道证实，长时间有氧运动后大鼠心肌线粒体总钙量增加，游离钙减少，力竭运动后心肌线粒体游离钙浓度明显下降［13－14］。本实验中，心肌线粒体MDA、SOD、游离钙含量测定结果提示，力竭过度训练使大鼠心肌线粒体内氧自由基产生显著增多，抗氧化能力又显著减弱，从而引起线粒体内脂质过氧化产物生成增多而降解减少；同时，力竭运动可造成明显的心肌线粒体内钙稳态失调，线粒体游离钙浓度显著降低，这与已有报道一致。

综上所述，力竭性运动或过度训练会对大鼠心肌造成不同程度的损伤，其发生机制可能与氧自由基生成增加、抗氧化能力下降、细胞内Ca2＋超载、心肌局部酶活性的改变有关。因此，为确保运动员的身体健康，避免运动性心肌损伤，深入探讨运动训练导致心肌损伤的机制是非常重要的，也有助于我们进一步寻找加强心肌保护的方法与预防心肌损伤的措施。

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