应用量子点技术检测Bcl－2和P53在皮肤血管瘤中的表达＊

唐 甜， 张端莲

1武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科，武汉 430060

2武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，武汉 430071

皮肤血管瘤是常见的良性肿瘤之一，大多数血管瘤的生长会经历3个时期，即增殖期、退化期和退化完成期。研究发现，内皮细胞的增殖与凋亡在血管瘤的病理发生过程中发挥重要作用［1－2］。Bcl－2属于Bcl－2蛋白家族中的一员，在调节细胞存活或凋亡中起着重要作用［3］。P53是一种常见的肿瘤抑制蛋白，当细胞受到损伤时常常被激活，然后整合各种信号调节细胞的存活和死亡，它能够影响DNA 的修复和细胞周期检验点，在抑制肿瘤发生中起着重要作用。若P53发生突变，则会使本应凋亡的细胞增殖，导致肿瘤的发生［4－6］。关于Bcl－2和P53在皮肤血管瘤这种良性肿瘤不同时期中的表达的研究尚不多见。本课题采用免疫组织化学方法和量子点技术检测了Bcl－2和P53在血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中的表达，以探讨Bcl－2和P53在血管瘤由增生期向退化期转变过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

皮肤血管瘤蜡块收集自武汉大学人民医院病理科，存档年为2007～2010年，共38例，其中男性16例，女性22例，年龄2个月～18岁。周围正常皮肤组织5例。这些血管瘤所在的部位有头皮、眼睑、前额、耳背、颈部、上臂、背部、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。

1.2 主要试剂

即用型鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型免疫组织化学SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；量子点双染试剂盒（武汉珈源量子点技术开发有限公司）；浓缩型鼠抗人Bcl－2单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；即用型鼠抗人P53单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）；DEPC（美国Gibco公司）。

1.3 材料分组

将所有标本材料进行常规苏木精－伊红（HE）染色和免疫组织化学SP 法检测增殖细胞核抗原PCNA，按Mulliken分类标准并结合PCNA 的表达进行分组。结果显示增生期血管瘤24例，退化期血管瘤14例。5例血管瘤组织周围正常皮肤作为对照。

1.4 HE染色

常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡及HE 染色。

1.5 免疫组织化学SP法检测Bcl－2、P53和PCNA相关抗原

具体步骤见参考文献［2］。组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；抗原修复；5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min；PBS冲洗，5min×3次；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA－PBS稀释），37℃孵育10～30min；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（即链霉亲和素）（PBS稀释），37℃孵育10～30 min；自来水充分冲洗，复染，封片。

1.6 量子点双染色法检测Bcl－2、P53及PCNA

具体步骤见参考文献［2］。石蜡包埋组织切片，厚度3～4μm，烤片，脱蜡，水化，微波抗原修复，TBS洗涤，封闭缓冲液37℃湿盒孵育30min，滴加Bcl－2、P53及PCNA 抗体，TBS－T 漂洗3次，每次5 min，封闭缓冲液37℃湿盒孵育20 min；滴加稀释缓冲液稀释的QDs－SA，37℃湿盒中孵育30 min，TBS－T 洗涤3次，每次5min，待组织标本干后，用缓冲甘油封固剂封片；荧光显微镜下紫外（针对波长为545nm 的QDs－SA）或蓝光激发（针对波长为605 nm 的QDs－SA）观察成像。

1.7 免疫组织化学染色结果和量子点染色结果判断

①Bcl－2以胞膜或胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应，P53和PCNA 以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞质内无棕黄色反应物。②采用美国CRI公司Nuance Fx多光谱成像系统对Bcl－2和P53的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均吸光度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均吸光度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积）。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 HE染色

正常皮肤组织中的毛细血管由1到2个内皮细胞围成，管壁较薄，内皮细胞胞质薄，细胞核扁平（图1A）。增生期血管瘤组织中可见大量增生活跃的内皮细胞，呈条索状或团块状，内皮细胞核肥大而淡染（图1B）。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞明显减少，血管腔增大，血管间纤维变性、脂肪浸润，有血管腔闭塞，内皮细胞核扁平（图1C）。

图1 HE染色结果（×200）Fig.1 The results of HE staining（×200）

2.2 免疫组织化学SP法检测PCNA

以棕黄色颗粒为阳性判断标准，增生期核内弥漫分布棕黄色颗粒，血管瘤内皮细胞核肥大，PCNA表达强（图2A）；退化期血管瘤内皮细胞核扁平，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA 表达弱（图2B）。结合HE 染色结果和免疫组织化学SP 法检测PCNA，在38例标本中，增生期血管瘤有24例，退化期血管瘤有14例。

图2 免疫组织化学PCNA 染色结果（SP，×200）Fig.2 Immunohistochemical staining for PCNA（SP，×200）

2.3 免疫组织化学SP法检测Bcl－2和P53

Bcl－2的表达：增生期血管瘤内皮细胞胞质内可见较多棕黄色颗粒，Bcl－2表达较强（图3A）；退化期血管瘤内皮细胞胞质内无棕黄色颗粒沉积，Bcl－2表达极弱或无表达（图3B）；正常皮肤组织血管内皮细胞胞质内无棕黄色颗粒沉积，Bcl－2表达极弱或无表达（图3C）。

P53的表达：增生期血管瘤内皮细胞核内有较多棕黄色颗粒，P53表达强（图4A）；退化期血管瘤内皮细胞核内无棕黄色颗粒沉积，P53表达极弱或无表达（图4B）；正常皮肤组织血管内皮细胞核内无棕黄色颗粒沉积，P53表达极弱或无表达（图4C）。

图3 免疫组织化学Bcl－2染色结果（SP，×200）Fig.3 Immunohistochemical staining for Bcl－2（SP，×200）

图4 免疫组织化学P53染色结果（SP，×200）Fig.4 Immunohistochemical staining for P53（SP，×200）

2.4 量子点双染色法检测Bcl－2、P53和PCNA

量子点双染以绿色荧光表示PCNA 阳性表达以显示细胞核，红色荧光表示Bcl－2阳性表达。正常皮肤组织血管内皮细胞内未见Bcl－2 表达（图5A）；增生期血管瘤组织内皮细胞胞质和胞膜可见Bcl－2高表达（图5B）；退化期血管瘤组织细胞胞质和胞膜可见Bcl－2低表达（图5C）。

量子点双染以绿色荧光表示P53 阳性表达。正常皮肤组织血管内皮细胞内未见P53 表达（图6A）；增生期血管瘤组织内皮细胞胞核可见P53高表达（图6B）；退化期血管瘤组织内皮细胞胞核可见P53低表达（图6C）。

图5 Bcl－2量子点双染色结果（×200）Fig.5 Quantum dots double staining for Bcl－2（×200）

图6 P53量子点双染色结果（×200）Fig.6 Quantum dots double staining for P53（×200）

2.5 统计学分析量子点染色Bcl－2和P53结果

图像分析结果经q检验，增生期组与退化期组和正常皮肤组之间，Bcl－2和P53的平均吸光度值及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05），见表1和表2。

表1 量子点染色法检测不同时期血管瘤Bcl－2的平均吸光度值和阳性面积率（±s）Table 1 Quantum dots double staining for detection of the average absorbance and the rate of positive area of Bcl－2in human dermal hemangiomas at different stages（±s）

表1 量子点染色法检测不同时期血管瘤Bcl－2的平均吸光度值和阳性面积率（±s）Table 1 Quantum dots double staining for detection of the average absorbance and the rate of positive area of Bcl－2in human dermal hemangiomas at different stages（±s）

与增生期组比较，＊P＜0.05

组别n 视野数平均吸光度值阳性面积率增生期组24 145 0.394 1±0.021 0 0.401 2±0.022 7退化期组14 115 0.174 9±0.019 5＊0.157 3±0.007 4＊正常皮肤组5 35 0.170 4±0.018 4＊0.148 6±0.005 7＊

表2 量子点染色法检测不同时期血管瘤P53的平均吸光度值和阳性面积率（±s）Table 2 Quantum dots double staining for detection of the average absorbance and the rate of positive area of P53in human dermal hemangiomas at different stages（±s）

表2 量子点染色法检测不同时期血管瘤P53的平均吸光度值和阳性面积率（±s）Table 2 Quantum dots double staining for detection of the average absorbance and the rate of positive area of P53in human dermal hemangiomas at different stages（±s）

与增生期组比较，＊P＜0.05

组别n 视野数平均吸光度值阳性面积率增生期组24 145 0.473 5±0.030 7 0.398 7±0.030 4退化期组14 115 0.178 1±0.021 4＊0.095 4±0.005 9＊正常皮肤组5 35 0.176 0±0.019 7＊0.090 2±0.005 1＊

3 讨论

婴幼儿皮肤血管瘤，是一种以内皮细胞为特征的良性血管肿瘤。血管内皮细胞在血管瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，而血管内皮细胞又受一系列正调控因子和负调控因子的调节［7－10］。一般认为血管内皮细胞的增殖与消退是血管瘤生长和消退的关键原因。细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因调控的细胞主动死亡的过程［11－12］。Bcl－2蛋白是一种癌基因，在多种恶性肿瘤的形成过程中起着重要作用，与其它癌基因不同的是，它不促进细胞增殖而是抑制细胞凋亡［13－15］。

本实验结果表明，增生期血管瘤内皮细胞Bcl－2的表达水平高于退化期和正常皮肤组织，差异均有统计学意义。提示Bcl－2在增生期血管瘤内皮细胞中的高表达，可能是通过抑制血管内皮细胞的凋亡，使血管瘤组织增殖和凋亡失衡，导致增生期血管瘤内皮细胞大量增殖。因此我们认为：细胞增殖的增加和细胞凋亡的相对抑制共同参与了血管瘤的形成和发展过程。

P53基因是一种与肿瘤发生、发展密切相关的抑癌基因，在细胞周期运行、细胞分化及凋亡的调控中起重要作用，研究发现约50%以上的肿瘤发生与P53基因的突变有关［16－18］。P53基因分野生型（wt－P53）和突变型（mt－P53）。野生型P53 基因一旦突变形成突变型p53基因，则不能抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，结果使细胞数目持续增加。在实际研究中，野生型P53蛋白在正常组织内含量低，利用免疫组化和量子点方法只能检测到突变型P53 蛋白的表达［19］。

本实验采用免疫组织化学方法和量子点对突变型P53蛋白在38例人血管瘤组织中的表达进行了检测，并结合PCNA 的表达对血管瘤进行比较准确的分期。实验结果表明，退化期血管瘤内皮细胞P53表达水平与正常皮肤组织相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；而增生期血管瘤内皮细胞P53表达水平高于退化期，差异有统计学意义（P＜0.05）。P53在血管瘤退化期的表达降低，而在血管瘤增生期的表达水平较高。这一结果与血管瘤不同时期中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平是一致的［20－21］。多项研究表明，P53可通过促进VEGF 的表达促使肿瘤的血管生成，而且在许多肿瘤组织中都检测到了P53与VEGF的共同表达及其表达间的正相关性［22］。P53可能是通过上调VEGF 的表达来促进血管瘤形成的。此外，研究发现在依赖于P53蛋白的细胞凋亡中，P53 基因是通过调节Bcl－2 和Bax基因的表达来影响细胞凋亡。P53蛋白能特异地抑制Bcl－2的表达，而对Bax的表达有明显的促进作用，P53蛋白是Bax基因的直接转录活化因子。若P53发生突变，则会降低这些细胞的凋亡。

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