干扰素γ 抑制IL-13 对成纤维细胞的纤维化作用*

熊丽霞， 李文林， 蔡震宇， 周 莹， 熊俊平， 赵 林， 何晓燕， 石小玉△

(南昌大学医学院1基础医学院病理生理学教研室，2江西省医学生物高技术重点实验室，3基础医学院组织与胚胎学教研室，4基础医学院人体解剖学教研室，江西 南昌330006)

纤维化发生可能是由于I 型与II 型细胞因子之间失平衡而引起的，并以II 型细胞因子反应为主。I型细胞因子可促进正常组织结构的修复，II 型细胞因子可使成纤维细胞增生活化，最终导致细胞外基质蛋白沉积和纤维化［1-2］。I 型细胞因子包括干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-12 及IL-18 等，II 型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13 和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)等。体内、外研究资料表明，当细胞因子的平衡以II 型细胞因子占优势时，就会发生纤维化［3］。IL-4、IL-13 等II 型细胞因子是通过刺激和激活转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信号转导通路来促进纤维生成［4］。

IFN-γ 是NK 细胞和T 淋巴细胞产生的具有高度生物活性的一种细胞因子。近年来，越来越多的研究显示IFN-γ 对纤维化的形成具有强烈的抑制作用［5］，具有抑制培养的成纤维细胞增生及胶原聚集等作用，与II 型细胞因子IL-4 及TGF-β 具有拮抗作用［6］，因此被认为是很有前途的抗纤维化药物之一［7］。IFN-γ 对IL-13 的促胶原合成作用是否具有拮抗作用?是否对瘢痕纤维化具有治疗作用?其效果如何?以上问题仍不清楚。我们前期实验结果显示IL-13 能够促进成纤维细胞的增殖、I 型前胶原mRNA 的转录和I 型胶原蛋白的合成，并证实了IL-13 的这些作用是通过将JAK/STAT6 信号转导中的转录因子STAT6 磷酸化来实现的［8-9］。本实验拟探明在体外培养条件下IFN-γ 对致纤维化因子IL-13对成纤维细胞促胶原合成作用的拮抗作用及其对纤维化的治疗效果，为进一步探讨纤维化的机制提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞株 成纤维细胞3T3 细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 主要试剂 细胞因子IL-13 购于PeproTech;DMEM 培养基购于Gibco-BRL，按说明书配制，4 ℃保存;特级胎牛血清购于杭州四季青生物制品公司，使用前56 ℃水浴30 min 灭活补体后分装，－20 ℃保存。MTT 购于Sigma;DMSO 购于上海华美生物工程公司。重组人IFN-γ 购于上海克隆生物高技术有限公司。羟脯氨酸试验检测盒购于南京建成生物工程研究所。RT-PCR 试剂购于TaKaRa。Western blotting 试剂:羊抗I 型胶原蛋白抗体、羊抗actin 抗体购于Santa Cruz;兔抗羊IgG-HRP 购于北京中山生物技术有限公司。

1.3 RT-PCR 引物的设计和合成 引物利用Primer Premier 5.0 软件，参照GenBank 中I 型胶原α1 基因(collagen type I alpha 1，Col1A1)(登录号为NM－007742)的序列设计，由TaKaRa 公司(大连宝生物)合成。Col1A1 引物序列(产物378 bp):上游引物5’-ACAGAGGCATAAAGGGTCA-3’，下游引物5’-CAAGGTCACGGTCACGAA-3’;β-actin 引物序列(产物511 bp):上游引物5’-AgCGGGAAATCGTGCGTGAC -3 ’， 下 游 引 物 5 ’-AAGCATTTGCGGTGGACGAT -3’。

2 方法

2.1 成纤维细胞常规培养及分组 成纤维细胞常规培养在含15%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。取对数生长期成纤维细胞，调整其细胞密度为(5 ×108)～(1 ×109)/L。在羟脯氨酸释放实验、RT-PCR 和Western blotting 实验中均分为实验组和空白对照组。实验前，每组细胞均用无血清DMEM 培养12 ～16 h，实验组:IL-13(100 μg/L)(浓度参考见文献［9］)+IFN-γ(4 ×105U/L)作用成纤维细胞24、48 和72 h，再进行以上各实验。然后进行对比实验，分成4 组:空白对照组、IFN-γ 组、IL-13 组和IFN-γ+IL-13 组，72 h 后检测Col1A1 mRNA 表达和I 型胶原蛋白的表达水平。

2.2 MTT 实验 将细胞以2.5 ×107/L 密度接种于96 孔培养板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2孵箱中培养至细胞贴壁，分6 组，分别为:空白组(不加细胞)、对照组(不加细胞因子)、IFN-γ(2 ×105U/L)组、IFN-γ(4 ×105U/L)组、IFN-γ(6 ×105U/L)组和IFN-γ(8 ×105U/L)组，每组3 孔，共接种18 孔，5%CO2、37 ℃温箱中培养20 h，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，吸弃培养基，用无血清培养液洗1 次，加150 μL 二甲基亚砜溶解沉淀，振荡10 min，结晶物溶解。比色:选择570 nm 波长，在酶联免疫检测仪上，以空白孔调零，测定各孔吸光度(A)。以空白未加药物组作为对照组，其余各组抑制率(%)=(1－A实验组/A对照组)×100%。

2.3 羟脯氨酸释放实验( 总胶原含量测定) 细胞培养上清液进行羟脯氨酸释放实验，比较各实验组和空白对照组羟脯氨酸含量的差别，按试剂盒说明操作。

2.4 RT-PCR 法 各组细胞均用SV total RNA isolation system 提取总RNA，逆转录合成第1 条cDNA，使用Col1A1 和β-actin 特异性引物，按照TKR RTPCR kit 标准程序进行扩增，内参照β-actin 与Col1A1 在同一管内扩增，进行1.5%琼脂糖电泳。

2.5 Western blotting 实验 各组细胞用RIPA buffer将细胞充分裂解，Bio-Rad Dye Reagent 进行蛋白定量。调整样品中蛋白质含量，均以20 μg 蛋白量上样进行7%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维膜转印。50 g/L 脱脂奶粉4 ℃封闭，TBS 洗涤，经I 型胶原蛋白第I 抗体和第II 抗体分别孵育后，ECL 试剂显像。再利用清除缓冲液清除硝纤膜上已结合的I抗和II 抗，重新经β-actin I 抗、II 抗孵育后，再次显像，作为内参照。对结果利用凝胶定量软件Quantity One(Bio-Rad)进行吸光度分析。

3 统计学处理

实验重复3 次。数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，以单因素方差分析进行差异显著性检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 IFN-γ 对成纤维细胞增殖的影响

用不同浓度IFN-γ 作用成纤维细胞，MTT 法检测IFN-γ 对成纤维细胞增殖的作用，当IFN-γ 浓度在2 ×105U/L ～8 ×105U/L 时，细胞抑制率明显上升。为此，我们取4 ×105U/L 作为IFN-γ 对成纤维细胞作用的浓度，见图1。

Figure 1. The anti-proliferation effect of IFN-γ on fibroblasts.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 U/L.图1 不同浓度IFN-γ 对成纤维细胞生长的影响

2 IFN-γ 抑制IL-13 对成纤维细胞分泌总胶原含量的影响

羟脯氨酸是胶原分解代谢的产物，机体内的羟脯氨酸主要存在胶原中，因此，羟脯氨酸是反映胶原含量的重要指标。前期实验结果显示IL-13 刺激成纤维细胞24 h 后分泌的总胶原含量增高，48 h 组显著高于对照组(P ＜0.05)，持续至72 h(P ＜0.01)，本研究结果显示IFN-γ +IL-13 作用成纤维细胞后，在24 h 与空白对照组相比可见分泌的总胶原含量减少，48 h 显著减少(P ＜0.05)，72 h 减少更加明显(P＜0.01)，见图2。

Figure 2. Hydroxyproline release of fibroblast cells in experimental group.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h.图2 IFN-γ+IL-13 作用后成纤维细胞羟脯氨酸的变化

3 IFN-γ 抑制IL-13 对Col1A1 mRNA 水平的影响

RT-PCR 结果显示，在空白对照组、IFN-γ 和IL-13共同作用的实验各组都出现了明显的Col1A1 mRNA 表达，比较各实验组Col1A1 mRNA 表达与空白对照组相比，实验24 h 组有所减弱，实验48 h 和72 h 组有显著减弱(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见图3。进一步进行各因素比较，分成空白对照组、IFN-γ 组、IL-13 组和IFN-γ+IL-13 组，72 h 后观察到IFN-γ 组Col1A1 mRNA 表达显著低于空白对照组(P ＜0.05)，IL-13 组显著高于空白对照组(P ＜0. 05)，而IFN-γ+IL-13 组显著低于其它组(P ＜0.01)，见图4。这说明IFN-γ 可抑制IL-13 的促成纤维细胞Col1A1 mRNA 表达作用。

Figure 3. Effect of IFN-γ on IL-13-induced Col1A1 mRNA expression. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图3 IFN-γ 对IL-13 促成纤维细胞Col1A1 mRNA 表达的影响

Figure 4. Effects of IFN-γ and IL-13 on Col1A1 mRNA expression. Mean±SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs IFN-γ+IL-13.图4 IFN-γ 和IL-13 对成纤维细胞Col1A1 mRNA 表达的影响

4 IFN-γ 抑制IL-13 的促成纤维细胞I 型胶原蛋白表达作用

Western blotting 结果显示，空白对照组及实验各组均出现了I 型胶原蛋白条带，灰度分析表明IL-13(100 μg/L)和IFN-γ(4 ×105U/L)作用24 h 后，I 型胶原蛋白表达有所减弱，48 h 组显著减弱(P ＜0.05)，72 h 组减弱最明显(P ＜0.01)，见图5。进一步在蛋白水平进行各因素比较，分成空白对照组、IFN-γ 组、IL-13 组和IFN-γ+IL-13 组，72 h 后观察到IFN-γ 组成纤维细胞I 型胶原蛋白的表达显著低于空白对照组(P ＜0.05)，IL-13 组显著高于空白对照组(P ＜0.05)，而IFN-γ +IL-13 组显著低于其它组(P ＜0.01)，见图6。这说明IFN-γ 抑制IL-13 的促成纤维细胞I 型胶原蛋白表达作用。

讨 论

Figure 5. Effect of IFN-γ on IL-13-induced expression of collagen type I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.图5 IFN-γ 对IL-13 促成纤维细胞I 型胶原蛋白表达的影响

Figure 6. Effects of IL-13 and IFN-γ on the expression of collagen type I. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs IFN-γ+IL-13.图6 IFN-γ 和IL-13 对成纤维细胞I 型胶原蛋白表达的影响

纤维化的发生可以影响到包括心、肺、肝、肾及皮肤等器官，纤维化已经成为医学上一个重要的病因学问题［10-11］。动物实验和临床研究均表明，II 型细胞因子和TGF-β 在纤维化形成过程中起着非常重要的作用，而在I 型细胞因子占优势的小鼠组织中与修复相关的许多基因被上调，这时无纤维化显著活化的证据，说明IL-13 和TGF-β 为致纤维化因子，而IFN-γ 具有抑制纤维化作用。Tredget 等［12-13］证实瘢痕组织和成纤维细胞的TGF-β mRNA 和蛋白水平在体内外被IFN-γ 和IFN-α 中和;并且观察了烧伤后1年发展成肥厚性瘢痕的病人，1 年内连续用流式细胞术观察T细胞和细胞因子的作用，发现损伤1个月内血清中未测到IFN-γ，损伤2 个月后IL-4 和IL-13阳性Th2 细胞比对照组显著增加，在瘢痕组织中IFN-γ mRNA 水平下降而IL-4 mRNA 水平增高，这充分说明了烧伤后肥厚性瘢痕病人极化的Th2 细胞效应。Aliprantis 等［14］和Lakos 等［15］的研究表明IL-13是一个重要的前纤维化介质，通过下调转录因子Tbet 减少组织IFN-γ 水平而促进博莱霉素诱导的皮肤纤维化。不少实验在一些纤维增生紊乱性疾病的研究中观察到IFN-γ 能抑制成纤维细胞分泌胶原［16］。Jordana 等［17］应用IFN-γ 治疗博莱霉素诱发的大鼠纤维化，发现组胺和羟脯氨酸的含量明显降低，肺纤维化的程度减轻。

本研究观察到4 ×105U/L 浓度的IFN-γ 对体外培养的成纤维细胞能达到最大抑制作用，并能抑制IL-13 的促Col1A1 转录和I 型胶原蛋白合成作用，说明I 型细胞因子的抗纤维化效应可以对抗II 型细胞因子的纤维化效应，也进一步证实了IFN-γ 有抑制纤维化的作用。Grassegger 等［18］确定了IFN-γ 在临床皮肤病中的显著作用，认为IFN-γ 是抗增殖和抗纤维化的关键的免疫调节因子，可应用于多种纤维化条件下，如硬皮病性皮肤纤维化、自发性肺纤维化、放射后皮肤纤维化等。分析其机制可能是:(1)抑制成纤维细胞有丝分裂;(2)降低I 和III 型前胶原α 链的mRNA 稳态水平;(3)刺激胶原酶的产生，并能抑制胶原合成所必需的脯氨酸羟化酶的产生，因此，IFN-γ 具有抑制创伤修复的作用，是创伤与瘢痕修复的负性调节因子。

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