Runx2 通过抑制细胞巨自噬以诱导C2C12 细胞向成骨细胞分化*

余守和， 洪 岸

(基因工程药物国家工程研究中心，教育部基因组药物工程研究中心，广东省生物工程药物重点实验室，暨南大学生命科学技术学院生物医药研究院，广东 广州510632)

Runx2(又称Cbfa1、AML3 或PEBPa2A)是调节成骨分化及骨发育的关键因子，由Runt 结构域介导与顺式原件OSE2(5'-TGTGGT-3')结合启动靶基因转录［1］。Runx2 缺陷型的纯合体小鼠缺乏骨骼矿化的能力，产后立即死亡;杂合体可存活，但骨骼系统存在缺陷［2］。Runx2 过表达的转基因小鼠出现骨质疏松的症状［3］。可见Runx2 在骨发育过程中的重要作用。

细胞巨自噬(macroautophagy，后称之为自噬)是互补于泛素-蛋白酶体的另外一种胞内蛋白降解途径，具有进化保守性［4］，是维持细胞稳态的重要因素。细胞自噬的顺利进行依赖于胞内一种囊泡的形成，即自噬体(autophagosome)。在自噬体中包被有受损的细胞器，错误折叠的蛋白，或蛋白聚集体等，它通过与溶酶体(lysosome)融合形成自噬溶酶体(autolysosome)以降解这些包被物［5-6］。自噬具有高度选择性，这依赖于货物受体(cargo receptor)与包被物的识别与结合，如Nbr1 与p62［7］。在生理条件下，细胞存在基础水平的自噬，这种自噬具有维持细胞正常功能的作用［8］。在环境胁迫时自噬会被诱导增强，这种自噬则有抵御胁迫，延长细胞生存期，增强其活力的作用［9］。自噬可参与众多生理过程的调节，如神经退行性疾病发生，肿瘤形成，病原体感染及衰老等。目前发现自噬对机体骨形成及骨骼发育有重要调节作用［10］，但相关分子机制并不清楚。

在本研究中，我们利用已有的单因子诱导成骨分化模型C2C12/Runx2Dox［11］解析Runx2 调控成骨分化与自噬的关联性。研究发现在诱导C2C12 细胞分化为成骨细胞过程中，Runx2 可抑制与自噬体形成密切相关基因微管相关蛋白1 轻链3b(microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，LC3b)及Beclin-1 表达，并可抑制LC3-I 向LC3-II 的转换。抑制自噬可增强Runx2 诱导的成骨分化，而激活自噬则具有抑制作用。据此我们认为Runx2 通过阻断自噬过程以诱导C2C12 细胞向成骨分化。

材 料 和 方 法

1 细胞与试剂

1.1 细胞 C2C12/Runx2Dox细胞是利用Tet-On Advanced 基因表达系统在小鼠成肌细胞C2C12 中建立的由Dox 调节Runx2 表达的单因子诱导成骨分化模型，为本实验室自己构建。

1.2 试剂 Trizol reagent 与G418 购自Invitrogen;Tet-On System 专用胎牛血清与强力霉素(doxycycline，Dox)购自Clontech;潮霉素(hygromycin，Hyg)购自Merck;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)购自Santa Cruz;雷帕霉素(rapamycin，Rap)购自Sigma;LC3 抗体购自Novus;β-actin 抗体及相关II 抗购自Cell Signaling;ECL 化学发光显色试剂盒购自Pierce;BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒，WB/IP 细胞裂解液及BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天公司;RNA 逆转录及实时定量PCR 所用试剂均购自宝生物工程公司;柯达胶片购自广州威佳;其它所用试剂及引物均购自上海生工。

2 方法

2.1 细胞培养 用含有10% Tet-On System 专用胎牛血清的DMEM 培养基培养C2C12/Runx2Dox细胞，并加入500 mg/L Hyg 与800 mg/L G418，置于37℃、5% CO2培养箱中，隔日换液1 次，细胞经传代和收获，取对数生长期细胞进行实验。为分析Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨分化与自噬的关系，在培养液中加入Dox (10 mg/L)分别培养0 d、1 d、3 d 及6 d 后收RNA 与蛋白样品进行相应分析。

2.2 总RNA 抽提 细胞培养好后用PBS 洗2 遍，并加入适量Trizol 试剂室温充分裂解10 min，后收集于1.5 mL Eppendorf 管中。每管样品加入1/5 倍体积的氯仿，剧烈振荡混匀30 s，室温静止10 min，4℃下12 000 r/min 离心15 min。取上清液至新的Eppendorf 管，加等体积异丙醇，-20 ℃静置15 min。4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，弃上清，DEPC 水配制的75%乙醇0.5 mL 洗涤沉淀1 次，12 000 r/min 离心10 min。弃上清，空气干燥10 min，加50 μL DEPC 水溶解RNA 沉淀，置于-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 逆转录PCR ( reverse transcription PCR) 取1 μg 总RNA 并加入DEPC 水到总体积为12 μL，65 ℃保温5 min 使RNA 变性。随后立即冰上冷却，以防RNA 复性。在该PCR 管中分别加入0.5 μL 随机引物，Oligo dT 引物，RNase inhibitor，逆转录酶MMLV，2 μL 10 μmol/L dNTP，4 μL 5 ×buffer，将上述20 μL 反应溶液30 ℃保温10 min，42 ℃保温60 min，72 ℃保温10 min，最终逆转为所需的cDNA。

2.4 实时定量PCR( real-time quantitative PCR) 采用SYBR Green PCR Master Mix 试剂，在基因公司的扩增仪上进行反应，PCR 反应体系为:cDNA 1 μL，基因上、下游10 μmol/L 引物各0.8 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，加H2O 补至20 μL。同时按照相同方式准备检测内参表达水平的反应液。每个样品设3 个复孔。反应条件为:95 ℃10 s 预变性，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，40 个循环。操作步骤按照说明书进行。反应结束后，使用系统软件分析PCR 过程各检测样本的Ct (threshold cycle)值。由熔解曲线判断PCR 反应的特异性，用基于2-ΔΔCt方法进行相对定量分析。检测分析时所用内参照是18S rRNA。所用PCR 引物都由上海生工合成，见表1。

表1 实时定量PCR 检测所用引物的序列Table 1. The sequences of the primers used for real-time qPCR detection

2.5 Western blotting 检测LC3-I 向LC3-II 的转换情况 按照碧云天WB/IP 细胞裂解液配送的蛋白提取说明书抽提总蛋白，并用BCA 蛋白定量试剂盒分析抽提蛋白浓度。采用15% 胶上样40 mg 总蛋白进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，并在4 ℃条件下转至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，4 ℃Ⅰ抗孵育过夜，洗涤后Ⅱ抗室温孵育1 h。再次洗涤后使用ECL 化学发光显色试剂盒显影，胶片(柯达)曝光。

2.6 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP) 染色

将培养好的细胞用PBS 洗3 次以去除培养基，而后用95%乙醇固定细胞10 min，晾干，依照碧云天的BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒所提供的相应操作步骤进行染色分析，并晾干拍照。

3 统计学处理

用SPSS 13.0 软件进行统计分析处理，数据以均数±标准差(mean ±SD)表示，使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间有显著差异者用LSD-t 检验进行两两比较，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨细胞分化时可下调LC3b 及Beclin-1 表达

用Dox (10 mg/L)处理C2C12/Runx2Dox细胞0 d、1 d、3 d 及6 d 后进行real-time qPCR 分析，首先检测了Runx2 及成骨分化标记基因ALP 及OC 的表达情况(图1A)，结果发现三者的表达水平明显上调的，说明诱导分化模型的可靠性。在此基础上我们进一 步 分 析 了 LC3b、Beclin-1、SQSTM1/p62 和LAMP-2 的表达，结果发现Runx2 可明显下调LC3b(图1B)与Beclin-1(图1C)表达水平，特别是自噬体标记基因LC3b，但对SQSTM1/p62 与LAMP-2 无明显影响(未提供数据)。此结果说明，Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨分化与自噬过程存在关联性。

2 Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨细胞分化时可抑制LC3-I 向LC3-II 的转换

Western blotting 检测结果表明，随着诱导时间延长，Runx2 的表达持续增加，在诱导6 d 时达最高水平(图2A 与2B)。同时发现Runx2 表达对LC3-I 向LC3-II 转换具有明显抑制作用，且这种抑制作用具有明显的诱导时间依赖性(图2C)。在Dox 处理3 d后，抑制效果就很明显(图2C)。LC3-II 的灰度扫描结果也说明了这一点(图2D)。此结果说明，Runx2诱导C2C12 细胞向成骨分化时可抑制自噬体形成，阻滞自噬流。

3 抑制自噬可促进Runx2 诱导的成骨分化进程

用0、1、3、5、10 及20 mmol/L 的3-MA 预处理细胞1 h，随后加入Dox (10 mg/L)诱导14 d 后进行ALP 活性分析。结果表明，与Dox 处理样品相比，在使用低浓度3-MA 时(1、3 及5 mmol/L)，ALP 活性随着处理浓度增加而增加;在使用高浓度时(10 与20 mmol/L)，ALP 活性随着处理浓度增加而降低(图3A)。进一步分析发现，低浓度的3-MA 对细胞没有明显毒性，但高浓度会导致细胞大量死亡(图3B)，这说明3-MA 高浓度所产生的ALP 活性降低现象是由于细胞数量减少导致的，揭示3-MA 增强ALP 活性的作用具有低浓度依赖性。此外，我们又用3-MA(5 mmol/L)分别处理细胞1 d、3 d 及6 d 后利用real-time qPCR 分析ALP 及OC 表达情况，结果发现3-MA 处理可明显促进二者表达(图3C 与3D)。此外，3-MA 处理对自噬相关基因的表达无明显影响(未提供数据)。以上研究结果说明，抑制自噬可增强Runx2 诱导C2C12 细胞分化为成骨细胞的能力。

4 激活自噬可抑制Runx2 诱导的成骨分化进程

Figure 1. The expression levels of LC3b and Beclin-1 were down-regulated during Runx2-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells. C2C12/Runx2Dox cells were treated with Dox (10 mg/L)for the times indicated.The mRNA levels of ALP (A)，OC(A)，Runx2(A)，LC3b (B)，and Beclin-1(C)were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs untreated sample (0 d).图1 Runx2 在诱导C2C12 细胞向成骨分化时下调LC3b 与Beclin-1 表达

Figure 2. The conversion of LC3-I into LC3-II was inhibited during Runx2-induced osteogenic differentiations of C2C12 cells. C2C12/Runx2Dox cells were treated with Dox (10 mg/L)for the times indicated. The protein levels of Flag-Runx2(A)and LC3(B)were detected by Western blotting. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs untreated sample (0 d).图2 Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨分化过程中抑制LC3-I 向LC3-II 的转换

Figure 3. The Runx2-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells was promoted by 3-MA treatment. A:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with the indicated concentrations of 3-MA for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of 3-MA for 14 d. The ALP activity was determined by ALP staining. B:Representative phase-contrast micrographs showing C2C12/Runx2Dox cells after 14 d of treatment with Dox or 3-MA (×100). C，D:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with 3-MA (5 mmol/L)for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of 3-MA for the time indicated. The mRNA levels of ALP and OC were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Dox-treated sample at each time point.图3 3-MA 处理可促进Runx2 诱导的C2C12 细胞向成骨分化进程

分别用0、0.05、0.1、1、5 和10 μmol/L 的Rap 预处理细胞1 h，随后用Dox(10 mg/L)处理14 d 后进行ALP 活性分析。结果发现，与Dox 处理样品相比，Rap 处理具有抑制ALP 活性的作用，且这种抑制作用具有浓度依赖性，在10 μmol/L 时Rap 具有显著的抑制效果(图4A)，且对细胞无明显毒性。此外，我们用Rap (10 μmol/L)分别处理细胞1 d、3 d 及6 d 后利用real-time qPCR 分析ALP 及OC 表达情况，结果发现Rap 处理可明显抑制二者表达(图4B 与4C)。此外我们也证实Rap 处理对自噬相关基因的表达无明显调节作用(未提供数据)。以上研究结果说明，激活自噬可减弱Runx2 诱导C2C12 细胞分化为成骨细胞的能力。

讨 论

在本研究中，我们利用单因子诱导分化模型C2C12/Runx2Dox分析Runx2 诱导成骨分化与自噬的关系。通过分析自噬体形成标志LC3-I/LC3-II 比值，揭示了Runx2 诱导成骨分化与自噬之间存在负相关关系。通过联合使用自噬抑制剂3-MA 及自噬激活剂Rap，进一步确认了二者之间的负相关关系。由此我们认为Runx2 通过抑制自噬体形成，阻滞自噬流，进而诱导C2C12 细胞分化为成骨细胞。

Figure 4. The Runx2-induced osteogenic differentiations of C2C12 cells was inhibited by Rap treatment. A:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with the indicated concentrations of Rap for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of Rap for 14 d. The ALP activity was determined by ALP staining. B，C:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with Rap (10 μmol/L)for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of Rap for the time indicated. The mRNA levels of ALP and OC were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA. Mean ±SD.n =3.* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Dox-treated sample at each time point.图4 Rap 处理可抑制Runx2 诱导的C2C12 细胞向成骨分化进程

一般来说，自噬可分为5 步，即诱导自噬，货物分子的识别与选择，自噬体的形成，自噬体与溶酶体的融合，货物分子的降解。在诱导C2C12细胞向成骨分化时，Runx2 可能会对自噬的某些步骤进行调节。在分析Runx2 诱导分化与自噬相关性时，我们首先在基因水平解析了Runx2 与自噬相关基因LC3b与Beclin-1 之间的表达负相关关系(图1B 与1C)。为进一步明晰Runx2 与自噬的关系，我们又在蛋白水平分析了LC3-I 向LC3-II 的转换情况，并证实Runx2 可显著抑制LC3-II 的形成(图2C)。由于LC3-II 是参与自噬体膜形成的重要组分［12］，其生成被抑制就会导致自噬体不能正常形成，自噬流被阻滞，可见Runx2 具有阻滞自噬流的作用。由于LC3-II 可以与自噬货物受体分子p62 结合，在自噬体与溶酶体融合后被降解掉，因此除通过分析LC3-II 水平分析自噬流外，检测p62 在蛋白水平的表达情况也是评估自噬流的一种方法［13］，这也提示我们p62表达水平发生变化可能是在蛋白水平，而不是基因水平。LAMP-2 是溶酶体的一种驻留蛋白，位于溶酶体膜上，负责调节自噬体与溶酶体的融合，缺失可导致融合受阻［14］。本研究发现在基因水平，Runx2 对LAMP-2 表达无明显影响，这说明Runx2 对自噬的阻滞应该不是通过影响后期融合过程实现的。依据上述分析，我们初步推断Runx2 对自噬的影响可能是在自噬体形成阶段。

自噬体这种具有生物膜的囊泡结构的形成是被自噬相关蛋白(autophagy-related proteins)调节的［15］，这也是自噬过程中最复杂的一个步骤。自噬体形成的双层膜是新生膜，其形成的基础是吞噬泡(phagophore)膜。Phagophore 膜有众多来源，可来自线粒体，高尔基体或是内质网［16］，新生膜就是在这些来源膜的基础上延展而来。延展过程首先依赖于PtdIns3K(class III phosphatidylinositol 3-kinase)复合体的形成，该复合体的激酶活性可被3-MA 靶向抑制，因此当我们用3-MA(5 mmol/L)处理细胞后发现ALP 活性明显增加(图3A)，这说明自噬体形成被抑制，自噬过程被阻滞后，Runx2 促C2C12 细胞向成骨分化能力增强了。此外，该复合体中有一个重要组分是Atg6/Beclin-1 在分化过程中，Runx2 可抑制该因子表达(图1C)，这说明Runx2 阻滞自噬过程的一种方式是通过下调Beclin-1 表达以抑制PtdIns3K 激酶复合体的形成。新生膜在延展时，需要征募磷脂酰乙醇胺修饰的LC3 (LC3-II)至phagophore 膜上［12］，这个过程对新生膜的形成是必须的。目前在分析胞内自噬体数量及自噬流强度时，都采用评估LC3-I/LC3-II 比 值 的 方法［17］。LC3-II 水 平 越 高，LC3-I/LC3-II 比值就越低，说明自噬体越多，胞内自噬流越强。在本研究中，我们发现Runx2 除抑制LC3b 转录外(图1B)，还对LC3-I 向LC3-II 的转换过程进行负调控(图2C)，最终阻滞新生膜的延展与自噬体的形成。综上可见，Runx2 一方面通过下调Beclin-1 表达的方式阻滞PtdIns3K 激酶复合体形成，导致起始phagophore 膜的组装受到影响，另一方面通过下调LC3-II 的水平，影响phagophore 膜的延展及新生膜的形成，最终通过抑制自噬体形成的方式阻滞自噬流，从而促进C2C12 细胞分化为成骨细胞。

自噬相关基因在转录水平上被调节是属于自噬的转录调节机制范畴，此外一些信号途径对自噬过程也有重要调节作用［15］。我们熟知的与自噬密切相关的就是雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途径。细胞在处于胁迫条件下，如营养缺乏、缺氧、或是被病原体感染，会使该途径失活，从而诱发自噬过程以抵御环境胁迫，维持生存需求。Rap 是该途径的特异性抑制剂。在本研究中，为提供自噬具有抑制Runx2 诱导C2C12 细胞向成骨分化的正向证据，我们用Rap(10 μmol/L)处理后发现ALP 活性显著降低(图4A)，这说明mTOR 途径与Runx2 诱导成骨分化的负相关关系。因此在后续研究中有必要分析在Runx2 诱导成骨分化过程中mTOR 途径的状态。

Runx2 是成骨分化、骨形成与骨骼发育的关键调节因子。Runx2 功能异常会引发一些遗传性疾病，如锁骨颅骨发育不全(cleidocranial dysplasia，CDD)综合征。依据我们的研究成果可初步推断，这些相关疾病的发生发展可能与自噬过程异常有一定的关联性。因此，该研究成果可能会为这些临床疾病的治疗提供一个全新的思路。

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