雪上一枝蒿体内外毒性研究

黄先菊，周 欢，蒋 逸，任 炜，郑 蜜，蔡光雄

(中南民族大学 药学院，武汉 430074)

雪上一枝蒿为毛茛科乌头属(Aconitum)植物短柄乌头的干燥块根，性温，味苦、辛，有剧毒，能祛风除湿、消炎镇痛，用于风湿骨痛、跌打肿痛和牙痛等症疗效显著[1]. 雪上一枝蒿含有甲、乙、丙、丁、戊、己、庚素，乌头碱，次乌头碱，3-去氧乌头碱，3-乙酰乌头碱，雪乌碱，丽鲁碱，准葛尔乌头碱，欧乌头碱等[2].雪上一枝蒿甲、乙、丙、丁素均有镇痛作用[3]，雪上一枝蒿速效止痛搽剂具有抗炎作用[4]，此外它还具有局麻、抗生育等作用[5].现代研究表明，乌头属植物可能具有一定的抗癌作用.乌头属植物多含aconitine型C19二萜生物碱[5]，主要有毒成分为乌头碱，一般中毒剂量为 0.2 mg，致死量为2.0～4.0 mg ，对神经系统先兴奋后抑制，消化系统表现为流涎、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，并直接作用于心脏，产生异常兴奋，可致心率失常，甚至室颤而死亡[6].

本文采用一次灌胃给药法观察雪上一枝蒿不同提取部位(石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位)对小鼠急性毒性作用，并以MTT法观察各个提取部位对Vero细胞的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 材料

昆明小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，购自湖北省实验动物中心[SCXK(鄂)2008-0005].Vero细胞株(武汉病毒所王汉中老师馈赠).雪上一枝蒿块根(购自安徽亳州药市)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640细胞培养基(GIBCO,Invitrogen,USA)，MTT(Biotech)，DMSO(天津科密欧化学试剂有限公司)，胰酶(Amerisco公司)，其他试剂均为分析纯.

全自动酶标仪(354型，上海Thermo公司)，CO2培养箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)，超净工作台(SW-CJ型，上海AIRTECH公司)，台式离心机(TDL80-2B型，上海安亭科技器材厂)，精密天平(AL204型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司).

1.2 方法

2.1.1 雪上一枝蒿不同提取物部位的制备

取雪上一枝蒿干药材100 g粉碎，置于1000 mL圆底烧瓶中，分别加10倍、8倍、5倍量95％的乙醇，回流提取3次，每次分别为3,2,1 h，3层纱布过滤，合并提取液，两层滤纸抽滤，再旋转蒸发，得23.6 g浸膏，用200 mL 0.2％的H2SO4超声溶解，用石油醚多次萃取(至石油醚萃取液澄清，即石油醚部位充分萃取，下同)，得石油醚萃取液，剩余液用氨水调pH值为9～10，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分多次萃取，分别得到氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液；将各种萃取液旋转蒸发、干燥后分别得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位.

2.1.2 雪上一枝蒿活性部位对Vero细胞的毒性

Vero猴肾细胞培养于含10％小牛血清，青霉素(100 μg/mL) ，链霉素(100 μg/mL)的PRMI-1640培养液中，置于37℃，5％ CO2，相对湿度100％的恒温培养箱中进行培养，每日观察细胞生长情况，定期换液，对生长密度超过80％瓶底面积的细胞进行消化传代.用D-hank’s液冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶1 mL消化液，置37℃约3～4 min，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失，表明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液2 mL，反复吹打，将细胞吹打均匀.每次传代的比例为1︰2，置于恒温培养箱里培养.实验用的细胞均处于对数生长期.

[7] ，选取生长处于对数期的Vero猴肾细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度，转移到96孔板中，12 h培养后加药处理(乙酸乙酯提取部位、氯仿提取部位、石油醚提取部位、正丁醇提取部位)，培养24 h后，每孔加入5 mg/ mL MTT 10 μL，继续培养2～4 h 后，去上清，加入150 μL DMSO溶解，于酶标仪492 nm处检测 OD 值，计算药物的处理后Vero细胞存活率.

2.1.3 急性毒性试验

预试验结果显示，氯仿部位的LD50约为40 mg/kg，石油醚部位和正丁醇部位的LD50约为5000 mg/kg.取健康昆明小鼠140只，实验前禁食12 h，不禁水，随机分成14组，每组10只，雌雄各半.分组包括空白组、氯仿部位组、石油醚组和正丁醇组，剂量比值为0.6，其中氯仿部位组分为78.13,62.5,50,40,32,25.6,20.48 mg/kg 各7组， ；石油醚部位组分为3000,5000,8333 mg/kg各3组；正丁醇部位组分为3000,5000,8333 mg/kg各3组.氯仿组和正丁醇组以高压灭菌水溶解药物，石油醚部位以植物油溶解药物，按10 mL/kg体积一次性灌胃给药，空白组一次性给同等体积的高压灭菌水，连续7 d观察动物的毒性表现和死亡数.

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 雪上一枝蒿活性部位对Vero细胞的活性影响

雪上一枝蒿氯仿提取物对Vero细胞作用24 h后的毒性结果见图1.如图1所示，62.5,125,250,500 μg/mL的氯仿提取物均导致Vero细胞存活率显著下降(P<0.01)，且具有剂量依赖性. 500 μg/mL氯仿提取物对Vero细胞的增值抑制率为63.9 ％.

ρ/(μg·mL-1)

雪上一枝蒿石油醚提取物对Vero细胞的毒性结果见图2.如图2所示，7.8,15.6,31.2 μg/mL的石油醚提取物对Vero细胞存活率无明显作用,62.5,125,250,500 μg/mL的石油醚提取物均导致Vero细胞存活率显著下降(P<0.01)，药物浓度为250 μg/mL和500 μg/mL时，细胞存活率均小于50％.500 μg/mL石油醚提取物对Vero细胞的增值抑制率为69.7 ％.

ρ/(μg·mL-1)

雪上一枝蒿正丁醇提取物对Vero细胞的毒性结果见图3.如图3所示，7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500 μg/mL的正丁醇提取物均导致Vero细胞存活率下降(P<0.05)，当药物浓度为500μg/mL时存活率最小，为67.1％,对Vero细胞的增值抑制率为32.9％.雪上一枝蒿乙酸乙酯提取物对Vero细胞的毒性结果见图4.

ρ/(μg·mL-1)

如图4所示，药物浓度为7.8,15.6,31.2,62.5,125,250 μg/mL时，对细胞无明显影响，500 μg/mL的乙酸乙酯提取物使Vero细胞存活率显著下降(P<0.01)，为81.8％，对Vero细胞的增值抑制率为18.2 ％.

ρ/(μg·mL-1)

2.2 雪上一枝蒿不同部位的急性毒性

雪上一枝蒿不同活性成分给药后4 h的中毒表观特征(主要是呕吐、腹式呼吸、怠动和腹泻)和死亡数统计结果见表1.

表1 急性毒性实验中毒表征和死亡数统计 (n=10，mean±SD)

由SPSS软件处理以上数据得到雪上一枝蒿氯仿部位，石油醚部位，正丁醇部位3种不同活性成分的LD50分别为37.991 mg/kg(95％置信区间37.131～45.185 mg/kg)，6766.928 mg/kg(95％置信区间5440.313～8477.545 mg/kg)，5492.337 mg/kg(95％置信区间4344.933～7293.847 mg/kg).

3 讨论

雪上一枝蒿治疗量与中毒量十分接近，若用量不当可以出现剧烈的毒性反应，甚至死亡。其主要毒性成分为乌头碱，中毒主要表现为出现心血管和神经系统症状。本文结果表明，雪上一枝蒿不同提取部位对小鼠均有不同程度的毒性作用，氯仿部位提取物毒性为高毒，对昆明小鼠的经口LD50为37.991 mg/kg，石油醚部位、正丁醇部位提取物微毒，对昆明小鼠的经口LD50分别为6766.928,5492.337 mg/kg.

国内有报道表明乌头碱具有心脏毒性、肝毒性和肾毒性[8]，本课题组前期研究亦发现乙醇总提物大剂量对猪肾PK-15细胞具有一定的毒性.本研究发现，500 μg/mL的氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物对Vero细胞的增值抑制率分别为63.9％,69.7％,32.9％和18.2％，表明4个提取部位对Vero细胞均有一定毒性，其毒性机制有待进一步研究.

参考文献

[1] 罗曙生.“雪上一枝蒿”急性中毒致严重室性心律失常1例[J].中国中医药现代远程教育,2010,8(19):54.

[2] 朱任宏,方圣鼎,黄伟光.中国乌头之研究V:雪上一枝蒿中的生物碱[J].化学学报,1964,30(2):139-145.

[3] 王本祥. 现代中药药理学[M].天津:天津科学技术出版社,1997,84.

[4] 王 璐,高菊珍,张红宇,等. 雪上一枝蒿速效止痛搽剂的抗炎镇痛作用研究[J]. 中药药理与临床,2005,21(4):52-54.

[5] 韩东铁.雪上一枝蒿的化学成分与药理作用研究概况[J].延边大学医学学报,2007,30(3):223-224.

[6] 许廷生,梁秀兰,卢 壮,等.乌头类药物中毒的防治[J].河南中医,2005,25(6):65-65.

[7] Matthieu F,Hinda D,Sanjib B,et al. Mesoporous silicanano particles enhance MTT formazan ecytosis in HeLa cells and astrocy[J]. Toxicol in Vitro,2009,23(4): 697-703.

[8] 刘 智,张大方,曲晓波,等.炮制对乌头生物碱的影响及毒性作用研究[J].时珍国医国药,2012,23(5):1113-1114.