CdTe量子点双层加壳增强其化学和生物稳定性

裴国凤，王海波，向荣华，梁晓声

(中南民族大学 生命科学学院，武汉430074)

作为一种新型的荧光材料，量子点具有激发光谱宽，分布连续，发射光谱呈对称性且半峰宽较窄，颜色可调的优势，与传统的有机染料相比其荧光寿命长、QDs稳定性好、荧光杂质少、不易漂白、与生物体链接后不影响其活性、特异性高，在生命科学中具有广阔的应用前景[1-3].量子点与荧光小分子相比亮度和稳定性均较大提高，但量子点在加热、高离子强度、氧化还原环境、金属离子等情况下均发生焠灭，严重地制约了量子点的应用.目前量子点荧光影像监测对病毒侵染等短时段行为的研究揭示了很多相关生物学问题.但对于较难生长的微生物，肠道菌群微生态的建立和变化，高等动植物的发育等过程，量子点还无法做到实时全程监测.

研究发现在合成完成量子点后再换用更稳温和无毒的元素(硫、锌等)进行加壳可大大提高量子点的量子效率、稳定性和生物相容性. Alivisatos等[4]利用硅酸酯水解技术首创了量子点的氧化硅结果包壳，使得量子点易于与蛋白和核酸等交联.水热合成量子点荧光效率高、合成简单、无需水/油相转化，降低了量子点合成成本.利用硅酸酯的Stober水解法用于合成抗热量子点或改善其荧光效率[5].基于Stober硅烷水解技术，本文设计了氨基硅烷试剂和硅酸酯2步水解，对量子点进行2步加壳，合成了热、化学、生物稳定性较好，适合超长时间影像的双层加壳量子点，最长可达7 d的荧光监测.

1 实验部分

1.1 样品、试剂和仪器

氨水(武汉洪山中南化工试剂有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(纯度98.0％，上海梯希爱化成工业发展有限公司)，正硅酸乙酯(TEOS，纯度98.0％，Fluka公司)，还原型谷胱甘肽(Sigma公司)，酵母浸粉和蛋白胨(Oxiod公司).葡萄糖、苹果酸、KH2PO4、NaBH4、CdCl2·2.5H2O、Na2TeO3、EDTA-Na2、CdCl2·6H2O、NaCl、I2、MgSO4·7H2O 、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为millpore超纯水.

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)，FA1004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，电子万用炉(北京永光明医疗仪器厂)，QYD-200全温培养摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司)，WD-9403E型手提紫外灯(北京六一仪器厂)，GeneGenius凝胶成像系统(Synoptics公司)，荧光光度计(F-2500，日本日立)，透射电子显微镜(H7650，日本日立).

1.2 CdTe量子点的合成及加壳

1.2.1 CdTe量子点的合成

量子点参照文献[6]合成，具体步骤为：依次将0.04 M CdCl216 mL，柠檬酸钠400 mg，苹果酸400mg，0.01 M Na2TeO316 mL，NaBH4200 mg加入三口圆底烧瓶中，补水至200 mL.在强磁力搅拌下加热至沸进行反应，约95 min后在紫外激发下有近550 nm绿色荧光时停止反应，得到发射峰约为550 nm的CdTe量子点胶体溶液.加入适量丙酮，离心弃上清，沉淀水重悬，稀释后用紫外分光光度计测定并计算浓度[7,8].

1.2.2 CdTe量子点的加壳

取5支10 mL的离心管加入6 mL纯化后的量子点(10 μM)加300 μL 6.25％氨水混匀，其中再分别加12 μL 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=30︰1,60︰1,120︰1,240︰1 (C9H23NO3Si为3-氨基丙基三乙氧基硅烷)的混合试剂；置于摇床中避光振荡1 h，使C9H23NO3Si能均匀地包覆在CdTe量子点的外面，再加入1188 μL 的r(H2O︰TEOS)=120︰1的混合试剂置于避光摇床中，振荡过夜.丙酮沉淀弃上清，纯水重悬.

1.3 利用量子点热抗性对加壳条件优化

取等浓度不同C9H23NO3Si加壳条件量子点各1 mL加入去离子水3 mL，在沸水浴中加热，每隔15 min取样60 μL，加热90 min，共取样7次， 用荧光分光光度计测其荧光发射峰面积，得出各种加壳条件量子点荧光强度随加热时间的变化对比图.

1.4 量子点的表征

1.4.1 量子点的荧光表征

取用优化条件加壳得到的量子点及为加壳的量子点对照，适当稀释与荧光分光光度计在380 nm激发光下测定其450～650 nm发射峰，测定数值以峰值为1进行归一化处理.

1.4.2 量子点的透射电子显微镜表征

滴一滴量子点溶液至封口膜上，把铜网的碳支持膜面盖在液滴上固定数分钟后，铜网盖在醋酸双氧铀液滴1～2 min，上自然干燥后制得TEM 样品.TEM 样品用透射电镜进行观察.

1.5 加壳量子点多种化学因素抗性评估

对半稀释法配制EDTA 5,2.5,1.25,0.625,0.3125 mM.取一块多孔板，向前三排中每孔加入100 μL 10 μM的CdTe量子点，后三排孔中每孔加入100μL 10 μM 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加壳CdTe量子点.向上述对应的量子点中每列依次加入配置好的EDTA溶液10 μL，根据量子点的淬灭情况(未加壳的量子点淬灭，加壳的量子点未淬灭)，获得最有差异效果的EDTA浓度.类似依次做CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、巯基还原剂、CoCl2的浓度梯度，获得最有差异效果的浓度.

同上分别配置最有差异效果浓度的EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和还原型谷胱甘肽溶液，检测金属离子对加壳量子点和未加壳量子点稳定性的影响.分别加入100 μL 10 μM的CdTe量子点和同样浓度的加壳量子点，10 μL上述络合剂、金属离子和氧化还原试剂，混合均匀，5 min后荧光分光光度计测定剩余荧光强度.

1.6 加壳量子点用于微生物超长时间影像

LB培养基分别培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌K12株至对数期，8000 g×5 min离心，弃上清，沉淀用合成培养基(配方为：2％葡萄糖，0.5％硫酸铵，0.05％磷酸氢二钾，0.001％七水硫酸亚铁，0.02％七水硫酸镁)洗涤1次，再离心，弃上清，沉淀用合成培养基稀释至OD为1.培养液中加入1/10 (V/V) 10 μM的加壳量子点，37°C培养箱培养，以2 h为间隔取样至荧光分光光度计测定至无荧光.

2 结果与讨论

2.1 利用量子点热抗性对加壳条件的优化

量子点通过二次加壳，可获得除热稳定性以外的对离子、螯合剂、氧化还原剂等不同程度的抗性.其抗性的获得取决于第一步氨基硅烷化试剂在量子点颗粒表面水解聚合形成有自由氨基的保护壳，加壳程度与其稳定性密切相关.本文以热稳定性为考核指标，优化了第一步氨基硅烷化试剂加壳剂量，结果见图1.如图1所示，与未加壳量子点相比，加壳量子点在热稳定性、加热后量子效率方面均有了显著的提高.以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1条件加壳的CdTe量子点提高荧光强度最为显著.因纳米材料为亚稳态物质，热能加快表面离子和分子的热运动，导致表面的镉和碲等元素从纳米颗粒上脱落下来，造成量子点荧光的减弱甚至焠灭.通过加壳限制表面离子的运动，提高了稳定性.本文在加壳材料中引入了氨基，氨基可与镉离子发生络合，在量子点周围形成高镉离子浓度的区域，使得表面离子更易达到吸附平衡不易脱落. 以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加壳的CdTe量子点热抗性最高，说明引入的氨基有效性最高，故后续表征和实验均以该条件加壳的量子点来进行.

1)未加壳量子点；2～4) 分别为r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1,120︰1,240︰1的加壳CdTe量子点

2.2 加壳量子点的表征

加壳量子点的TEM图结果见图2.由图2可见，量子点未加壳为点状，直径在5 nm以下，与文献报道符合，经加壳后不同纳米颗粒间的机硅酸酯水解相连形成了网状结构.未见明显的沉淀，故可以用于组织靶向、动物活体成像等方面.

a) 发射峰约550 nm未加壳量子点的TEM图； b) 发射峰约550 nm加壳量子点的TEM图

通过荧光分光光度计表征发量子点包壳前后发射光谱，结果如图3.图3显示未加壳量子点发射峰峰型较好，半峰宽较窄约50 nm，加壳后半峰宽变为100 nm左右.另外，加壳后最大发射峰发生轻微蓝移，说明在包壳过程中随着硅壳包覆，表面结合不够紧密的镉碲等离子丢失.因量子点发射光谱与直径相关，直径越小发射波长越短，加壳后半峰宽变宽表明量子点单分散性变差，颗粒大小不均一程度变大.

λ/nm

2.3 加壳量子点多种化学因素抗性

分别对加壳量子点进行了EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和还原型谷胱甘肽等化学稳定性实验结果见图4.由图4可见，图中显示除EDTA、CdCl2、CoCl2外，加壳量子点均较未加壳量子点抗性增强，尤其对高达0.5 M的氯化钠和远高于细胞内浓度的谷胱甘肽，说明该材料可适应大多数生化体内体外反映的条件.EDTA加壳未显示出良好的抗性则与其络合稳定常数太大有关.镉离子及钴离子显示了相反的趋势是由于前两者结合到量子点表面使量子点有效粒径变大，其发射峰往长波长红移.黄色量子效率最高[9]，本文所有量子点为黄绿色，红移往黄色移，故量子效率除了受金属离子负影响外还会有一定的增加，而包壳后的量子点镉离子被氨基屏蔽则没有这种增益效果.

1)加壳量子点；2) 未加壳量子点

2.4 加壳量子点用于微生物超长时间影像

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为例估加壳对其生物稳定性的影响.图5中显示，与金黄色葡萄球菌共同培养12 h，未加壳量子点荧光完全焠灭，而加壳量子点荧光还有80％以上剩余，直至168h以后才完全焠灭.可用于长达7 d的活体成像或肠道微生态影像，甚或一些难生长的微生物.与革兰氏阴性菌大肠杆菌K12株培养8 h，包壳量子点荧光完全焠灭，而加壳量子点至48h荧光才完全焠灭，因不同菌株产酸等能力有差异.

3 结论

(1)采用Stober法进行了量子点加壳，首创了3-氨基丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯2步水解加壳法，优化了加壳条件合成双层加壳量子点.

(2)评估了该量子点的化学稳定性，发现其对金属离子，氧化还原试剂均有很好抗性.

(3)以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为例，对加壳量子点超长时间生物影像能力进行了评估.发现其荧光可最多延续1周才完全焠灭，较未加壳量子点提高了10多倍.

a) 共培养微生物为金黄色葡萄球菌 b) 共培养微生物为大肠杆菌K12株

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