高效阴离子交换-积分脉冲法检测氨基寡糖素农药中游离氨基葡萄糖

陈炜瑶, 吴国权, 李 彬, 高凡钦

(1. 广西中医药大学，南宁 530000；2. 梧州市食品药品检验所，广西 梧州 543000；3. 赛默飞世尔科技 (中国)有限公司，上海 200135)

氨基寡糖素又称壳寡糖，是指D-氨基葡萄糖(GIcN) 以β-1,4 糖苷键连接的低聚糖，是一种低毒杀菌剂，可对多种病原菌的生长产生抑制作用，如影响真菌孢子萌发、诱发菌丝形态发生变异、使菌丝细胞内的生化反应发生改变等。此外，氨基寡糖素还能激发植物体内的基因表达，产生具有抗病作用的几丁质酶、葡聚糖酶、植保素及PR 蛋白等，并具有细胞活化作用，有助于受害植株的恢复，促根壮苗，增强作物的抗逆性，促进植物生长发育[1-2]。

氨基寡糖素同时具有杀菌及营养功能，使用过程中具有高效、低成本、无公害等特点，对中国农业可持续性发展具有重要意义，因此农业部2016年下发了关于氨基寡糖素母药 (NY/T 2889.1—2016) 及水剂 (NY/T 2889.2—2016) 质量的相关标准[3-4]，标准中对游离的氨基葡萄糖的限量作了明确规定。目前，国内外对氨基寡糖素中游离氨基葡萄糖的定量方法研究报道相对较少。李娟等[5]采用CarboPacPA10 分离了氨基寡糖素与氨基葡萄糖，但氨基葡萄糖易受到壳四糖与壳三糖的干扰，分离度达不到要求，定量容易受到干扰，尤其是在游离氨基葡萄糖含量较低时；刘艳霞[6]采用分光光度法检测了氨基寡糖素水剂中有效成分氨基寡糖素的含量，邵波等[7]采用离子色谱法快速检测了氨基寡糖素的含量，但并未对游离氨基葡萄糖进行定量研究。为解决氨基寡糖素与氨基葡萄糖之间分离度低的问题，本研究采用高效阴离子交换-积分脉冲法，在分析柱DionexCarboPac PA100 前添加一个氨基保护柱，利用氨基寡糖素与氨基葡萄糖分子中所带的氨基数量不同导致在氨基捕获柱上保留行为差异的特点，尝试将氨基葡萄糖与氨基寡糖素进行分离，并对其中的游离氨基葡萄糖进行了定量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo ScientificTMDionexTMICS-6000 离子色谱系统，包括：ICS-6000 四元梯度泵模块、ICS-6000 DC 模块 (含安培检测器) 、工作电极Au、参比电极Ag/AgCl；Thermo ScientificTMDionexTMAS-AP 自动进样器；Thermo Scientific™ Dionex™Chromeleon™ 色谱工作站。

氨基葡萄糖标准品 (纯度≥98%，BOC Sciences) ；质量分数为50%氢氧化钠溶液 (美国Fisher 公司) ；氨基寡糖素母药 (纯度≥85%，深圳诺普信农化股份有限公司) 。

1.2 色谱条件

保护柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×50 mm；分析柱：DionexCarboPac PA100，4 mm ×250 mm；氨基捕获柱：DionexAminoTrap Column，4 mm × 50 mm。柱温30 ℃；检测器箱控温30 ℃；定量环25 μL；安培检测器；工作电极：Au；参比电极：Ag/AgCl；波形：标准四电位波形。淋洗液及梯度条件见表1。

表1 淋洗液梯度程序Table 1 Eluent gradient program

2 结果与分析

2.1 氨基捕获柱对主成分及目标物保留行为的影响

由于氨基葡萄糖与氨基寡糖素均带有羟基及氨基，在以阴离子的形式分离以上目标物时，受氨基基团的影响，氨基葡萄糖与氨基寡糖素之间的分离度较差 (见图1，加氨基捕获柱前) 。由于普通样品中游离氨基葡萄糖含量相对较低，因此，采用该方法测定会影响对游离氨基葡萄糖定量的准确性。利用氨基寡糖素及游离氨基葡萄糖所携带的氨基数量不同的特点，在分析系统中增加一个氨基捕获柱，可以增强携带氨基基团较多的氨基寡糖素在氨基捕获柱上的保留，而氨基葡萄糖只含有一个氨基，在捕获柱上保留相对较弱，可快速地从保护柱上洗脱出，从而实现氨基葡萄糖与氨基寡糖素之间的分离 (见图1，加氨基捕获柱后) ，故采用此方法可消除氨基寡糖素对氨基葡萄糖的干扰，提高氨基葡萄糖定量结果的准确性。

图1 分析系统中增加氨基捕获柱前(A)后(B)对比图Fig. 1 The comparison diagram before(A) and after(B)adding an amino trap column in the analysis system

2.2 柱温的优化

柱温对目标物与杂质的分离也会产生影响。本方法比较了分别在25、30、35、40 和45 ℃柱温条件下氨基葡萄糖与杂质的分离效果，结果 (图2)表明，氨基葡萄糖会受到杂质1 及杂质2 的干扰。随着柱温的升高，目标物游离氨基葡萄糖的保留时间缩短。在柱温25 ℃时样品中杂质1 与目标物无法完全分离；柱温为30 ℃时，杂质1 的保留弱于目标物；随着柱温升高，杂质1 与氨基葡萄糖分离度变大，但样品中杂质2 会干扰目标物。综合考虑，最终选择30 ℃作为分析时的柱温。

图2 不同柱温下氨基葡萄糖与杂质离子分离图谱Fig. 2 Separation spectrum of glucosamine and impurity ions at different column temperatures

2.3 洗脱程序的优化

本方法是采用前段先等度洗脱，待目标物游离氨基葡萄糖被洗脱后，再加大淋洗液氢氧化钠溶液的浓度，将氨基寡糖素冲出色谱柱。图3 是对比前段不同浓度氢氧化钠溶液对目标物及杂质分离的影响。可见：随着氢氧化钠浓度的增加，氨基葡萄糖与杂质2 的分离度变大，但与杂质1 的分离度变小。当氢氧化钠溶液浓度为22 mmol/L时，杂质1 基本上全被包裹到目标峰内。综合考虑最佳分离度，确定前段等度洗脱的氢氧化钠的浓度在15～20 mmol/L 之间，故本方法采用浓度为17 mmol/L 的氢氧化钠溶液作为洗脱游离氨基葡萄糖的淋洗液。

图3 不同淋洗液(氢氧化钠溶液)浓度下氨基葡萄糖与杂质分离图谱Fig. 3 The separation of glucosamine and impurities with different eluent (sodium hydroxide solution) concentrations

2.4 线性范围、检出限及定量限

在选定的色谱条件下依次分析系列标准溶液，以各离子的色谱峰面积对浓度做标准曲线。结果显示：氨基葡萄糖在0.02～10 mg/L 范围内，色谱峰面积与药剂浓度间具有良好的线性关系，标准曲线方程为y= 4.2267x−0.0392，相关系数(r)为0.999 9。定量限(LOQ)为0.02 mg/L；以信噪比 (S/N) 为3计算得到检出限(LOD)为0.01 mg/L。

2.5 方法应用

在选定的色谱条件下，对市售氨基寡糖素农药母药及水剂样品进行平行分析，结果见表2。母药及水剂平行测试的相对标准偏差均小于1.9%，证明该方法在实际样品测定时具有较高的稳定性。

表2 氨基寡糖素母药及水剂样品分析结果Table 2 Analysis results of the amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution samples

依次向氨基寡糖素母药及水剂样品中加入低、中、高3 个水平的氨基葡萄糖标准品，进行添加回收试验。每个水平平行测定3 次。结果 (表3) 显示，氨基葡萄糖的平均添加回收率在90%～99%之间，RSD 在0.75%～1.9%之间，证明该方法在实际样品测定时具有较高的准确性。

表3 氨基寡糖素母药及水剂样品添加回收结果Table 3 The spiked recoveries for amino-oligosaccharin technical concentrates and aqueous solution

3 结论

本研究建立了高效阴离子交换-积分脉冲检测氨基寡糖素母药及水剂中游离氨基葡萄糖的方法，在保护柱DionexCarboPac PA100 前加装氨基捕获柱，利用氨基葡萄糖与氨基寡糖素所带氨基数量不同，导致在氨基捕获柱上的保留行为差异，可以使氨基葡萄糖与氨基寡糖素完全分离，使氨基寡糖素母药及水剂中的游离氨基葡萄糖检测结果更加准确可靠，从而更加准确地判断氨基寡糖素的含量。该方法具有操作步骤简单、分离效果好、通用性强、准确度和灵敏度高等优点，更适用于氨基寡糖素母药及水剂中游离氨基葡萄糖的快速定性和定量检测，也可为游离氨基葡萄糖在其他种类样品中的定性和定量检测提供参考。