基于荧光探针技术检测30 种农兽药及其二元、三元组合对CYP3A4 酶的联合毒性

朱新月, 陈立森, 何深贵, 赵 鑫, 程林丽, 崔京南*,

(1. 大连理工大学 精细化工国家重点实验，辽宁 大连 116000；2. 中国农业大学 动物医学院，北京 100193)

科学合理的农药或兽药混用，解决了农业生产中农兽药单剂存在的防治范围窄、防治效果低、易产生抗药性、成本高等问题[1]，但同时也导致生鲜食品中多种低残留农兽药污染物共存现象显著增加[2-4]，随之产生的联合毒性在遗传、神经、免疫系统、生殖和发育等方面对生物体产生了严重不良影响[5-6]。目前国内外对农兽药联合效应的研究资料相对较少，关于大批量二元和三元农兽药组合的研究更少。Kang 等[7]通过检测韩国养殖场中958 个鱼类样本的兽药残留发现，87 个样本检测到2 种及以上兽药残留，其中恩诺沙星和环丙沙星最常被检测到。马晨等[8]于2017—2019 年通过分析海南省主产区178 份芒果样品发现， 71.91%的样品同时含有2 种及以上的农药残留，最多同时检出8 种农药残留。研究发现，农兽药的联合毒性效应主要有加和性、协同性和拮抗性3 种类型[9]。Luan 等[10]研究了恩诺沙星与粘菌素和喹诺酮2 种兽用抗菌药物联用对大鼠肝脏的毒理学作用，结果表明3 种兽药混合使用后联合毒性显著增强；Cheng 等[11]评估了3 种新烟碱类农药混合物对人神经母细胞瘤SK-N-SH 和鳞翅类Sf-9 细胞的联合毒性，发现随着农药浓度或农药组合的变化，联合毒性呈现协同作用或者拮抗作用。这种联合毒性效应的不确定性对农兽药混剂的安全性构成潜在威胁。因此，相对于单元农兽药残留超标现象，多种农兽药残留对人体健康的联合毒性的研究同样需要引起重视。

利用发光细菌[12-13]、活细胞[14-15]或者生物体[16-17]作为靶标检测农兽药毒性，存在培育过程繁琐、实验周期较长、不适合大批量测试等问题。酶抑制法作为农兽药毒性检测方法之一，因具有成本低、操作方便、检测快速、高通量等特点，为筛查和监测多种混合农兽药联合毒性提供了新的思路[18]。CYP3A4 酶又称细胞色素P450 3A4 酶，是酶抑制法常用酶之一，主要存在于肝脏和小肠中，可以氧化外源性有机小分子 (如毒素或药物)，并参与环境致癌物的生物活化，它的表达受多种刺激的影响，包括杀虫剂和杀菌剂等环境因素。CYP3A4 酶在睾酮 (2β-、6β-或15β-羟基睾酮) 和雌激素 (4- 或16α-羟基雌酮) 的氧化中具有重要影响[19-20]，其个体差异可通过调节性激素代谢物水平在乳腺癌和前列腺癌的发生中起作用[21]，因此以CYP3A4 酶作为毒物毒性的生物学标志已广泛应用于毒理学研究。传统的CYP3A4 酶活性检测方法主要依赖于质谱法和高效液相色谱法[22-23]，设备复杂昂贵、操作过程繁琐耗时。近年来，荧光探针技术因其灵敏度高、选择性强等特点，已逐步应用于生物体内酶活性检测领域[24-25]，但是利用荧光探针检测混合农兽药的联合毒性效应还鲜有报道。

Ning 等[26]通过采用二维分子设计策略，成功开发出首个用于选择性检测CYP3A4 酶的荧光探针NEN (N-乙基-1,8-萘二甲酰亚胺)，为体外和体内内源性CYP3A4 酶活性的定量表征提供了新方法。本研究基于酶抑制法原理，将荧光探针NEN检测CYP3A4 酶活性方法进一步应用于农兽药毒性检测领域，建立广谱性筛查混合农兽药联合毒性效应的方法，并以常用的30 种农兽药及其典型的23 种二元和26 种三元组合为研究对象，检测农兽药混合物对CYP3A4 酶的联合毒性，通过比较单元与多元混合农兽药对CYP3A4 酶活性抑制率的变化程度，探究混合农兽药各组分之间的联合毒性效应，并进一步分析农兽药与CYP3A4 酶之间的构效关系，旨在为今后在细胞和动物水平制订农兽药混剂的风险评估方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

30 种农兽药标准品，购于北京万佳首化生物科技有限公司，并在 −10 ℃以下保存；混合人肝微粒体 (HLM)，购于上海瑞德肝脏疾病研究有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，购自萨恩化学技术上海有限公司安耐吉化学；葡萄糖-6-磷酸二钠 (G-6-P) 、葡萄糖-6 磷酸脱氢酶 (B 液) 和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠 (NADP+) ，购买于Sigma 公司；其他试剂均为市售色谱纯级别。

Scientific Sorvall WX 低温超速离心机 (美国Thermo 公司)；MS104S 分析天平 (瑞士Mettler toledo 公司)；MSC-100 恒温混匀仪 (上海金新实业有限公司)；PHS-3C pH 计 (上海仪电有限公司)；Research plus 移液枪 (德国Eppendorf 公司)；VORTEX-5 旋涡混合器 (海门其林贝尔仪器制造有限公司)；Bio-Tek Synergy H1 全功能酶标仪 (美国BioTek 公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 探针NEN 的合成表征及发光机理 根据Ning 等[26]报道的方法合成了CYP3A4 酶的高选择性探针底物NEN (结构式见图1)，乳白色固体，产率为63%。1H NMR(500 MHz, CDCl3),δ:8.65～8.58 (m, 2H), 8.21 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 7.79～7.73 (m, 2H), 4.26 (q,J= 7.1 Hz, 2H), 1.34 (t,J=7.1 Hz, 3H).

图1 NEN 对CYP3A4 酶的荧光响应机制Fig. 1 The fluorescence response mechanism of the probe NEN toward CYP3A4

NEN 对CYP3A4 酶的荧光响应机制如图1 所示[26]，NEN 在CYP3A4 酶催化作用下羟基化，生成N-乙基-4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺 (NEHN)，NEHN 的4 位酚羟基在生理条件下 (pH = 7.4) 转变为氧负离子，得到N-乙基-4-氧负基-1,8-萘二甲酰亚胺(NEON)，使得供电子能力增大，发射荧光强度增强，在465 nm 激发光照射下，发射558 nm荧光。

1.2.2 农兽药标准质量浓度的设定 以食品安全国家标准(GB 2763—2021、GB 31650—2019)[27-28]规定的食品中农兽药最大残留量作为农兽药测试的标准质量浓度，设定0.5、1.0 和3.0 倍标准质量浓度3 个梯度，并将农兽药残留量单位由mg/kg转变成mg/L；同时参考食品中农兽药残留的检出限和农兽药急性中毒的参考剂量，最终确定混合农兽药联合毒性测试的标准质量浓度。30 种农兽药的编号、结构式、标准质量浓度及抑制率如表1所示。

表1 30 种农兽药的编号、结构式、标准质量浓度及抑制率Table 1 The number, structural formula, standard mass concentration and inhibition rate of 30 pesticides and veterinary drugs

1.2.3 酶活性检测 CYP3A4 酶活性的测定体系：孵育体系的总体积200 μL，其中包括：NADPH生成系统 (1 mmol/L NADP+、10 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、1 Unit/mL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、4 mmol/L MgCl2和HLM (终浓度为10 μg/mL)，其余为PBS缓冲溶液 (100 mmol/L，pH = 7.4)。筛选实验分为2 组：对照组和抑制剂组，其中抑制剂组加入不同质量浓度的农兽药或者不同配比条件的农兽药混合物，对照组以等体积的空白溶剂二甲基亚砜(DMSO)代替农兽药。抑制剂或空白溶剂分别与探针底物NEN (终浓度为50 μmol/L) 在HLM 存在的体系中，于37 ℃ 孵育锅中预孵3 min，随后加入NADP+作为辅因子起始反应；反应30 min 后加入100 μL 冰乙腈沉淀蛋白终止反应。然后在4 ℃、13423 r/min 条件下离心10 min，取上清液于全功能酶标仪中进行荧光分析。激发波长设置为465 nm，发射信号波长采集为476～700 nm。最后通过对比对照组和抑制剂组在560 nm 发射波长下的荧光强度求算不同农兽药及组合对CYP3A4 酶活性的抑制率，每组样品设置3 个平行，得到平均荧光强度。按 (1) 式计算每种农兽药或者农兽药组合对CYP3A4 酶活性的抑制率(R)。

式中：A0为对照组平均荧光强度，A1为抑制剂组平均荧光强度。

1.2.4 基于效应相加模型评估联合毒性效应 效应相加模型 (effect summation, ES) 广泛应用于评价混合物联合毒性，该模型认为混合物的总效应是混合物各个组分效应之和，一般应用于化合物浓度-效应曲线(concentration-response curve，CRC)呈良好线性关系时[29]。

在测得农兽药单剂对CYP3A4 酶的抑制率后，根据ES 模型计算出二元和三元组合在相应质量浓度梯度下抑制率的加和值，二元和三元组合在各质量浓度梯度下的实测抑制率为相应梯度下2 种农兽药混合后测试得到的抑制率，差值等于实测抑制率减去抑制率的加和值。当差值大于零时，表明该二元或三元组合各组分之间具有协同作用；当差值小于零时，则表明具有拮抗作用。

1.3 数据处理

本研究用ChemDraw 软件绘制农兽药结构式，用 Origin 9.1 和 Excel 软件处理数据和绘制图表。

2 结果与分析

2.1 30 种农兽药单剂对CYP3A4 酶的毒性测定

结果(图2)显示：除对CYP3A4 酶活性无抑制作用的农兽药外，其他农兽药的浓度-抑制率曲线均呈良好的线性关系，故能够应用ES 模型探究本研究的联合毒性效应。

图2 30 种农兽药在3 种质量浓度梯度下对CYP3A4 酶活性的抑制率Fig. 2 The inhibition rate of 30 pesticides and veterinary drugs on CYP3A4 activity under three mass concentration gradients

在设定的标准质量浓度范围内，毒死蜱、咪鲜胺和哒螨灵对CYP3A4 酶的毒性最大，0.5 倍标准质量浓度即可达30% 以上的抑制率，分别为50.1%、42.2% 和32.6%，当超过最大残留量至3 倍标准质量浓度时，可分别达84.0%、73.2%和54.9%的抑制率；苯醚甲环唑、百菌清、甲基毒死蜱和氯氰菊酯对CYP3A4 酶的毒性次之，标准质量浓度下的抑制率分别为36.5%、35.6%、33.1%和28.3%；呋喃妥因、联苯菊酯、烯酰吗啉、异菌脲和虫螨腈对CYP3A4酶的毒性较强，标准质量浓度下的抑制率在10%～20%范围内；奥硝唑、高效氯氟氰菊酯、乐果、氟苯尼考和吡虫啉对CYP3A4 酶的毒性较弱，标准质量浓度时的抑制率在10%以下，0.5 倍标准质量浓度时在5%以下；乙酰甲喹、土霉素、多菌灵、环丙沙星、氧化乐果、克百威、恩诺沙星、速灭威、甲胺磷、替硝唑、呋喃它酮、氰戊菊酯和啶虫脒对CYP3A4酶的活性无抑制作用，在标准质量浓度和0.5 倍标准质量浓度下的抑制率均为负值。

2.2 23 种典型的农兽药二元组合对CYP3A4 酶联合毒性的测定

23 种典型的农兽药二元组合在3 个质量浓度梯度下对CYP3A4 酶的联合毒性测试结果如图3所示，3 个质量浓度梯度下均为协同作用的共有4 个组合，其中克百威 + 多菌灵 (6 + 18)、克百威 +吡虫啉 (6 + 17)、啶虫脒 + 烯酰吗啉 (16 + 20) 在标准质量浓度下的协同作用分别为22.5%、20.7%和15.1%，吡虫啉 + 多菌灵 (17 + 18) 在3 倍标准质量浓度下协同作用为10.7%。多菌灵 + 咪鲜胺(18 + 19)、多菌灵 + 苯醚甲环唑 (18 + 21)、克百威 + 啶虫脒 (6 + 16)、克百威 + 毒死蜱 (6 + 2)、恩诺沙星 + 环丙沙星 (27 + 26) 及恩诺沙星 + 土霉素(27 + 30) 等6 组组合，在标准质量浓度和3 倍标准质量浓度时具有协同作用，分别最高达9.6%、7.0%、4.7%、10.4%、3.6%及7.2%；毒死蜱 + 多菌灵 (2 + 18) 在标准质量浓度时有2.5%的协同作用，啶虫脒 + 多菌灵 (16 + 18) 在3 倍标准质量浓度时有5.9%的协同作用。

图3 23 种典型的农兽药二元组合分别在3 倍标准质量浓度 (a) 、标准质量浓度 (b) 、0.5 倍标准质量浓度梯度 (c)下对CYP3A4 酶活性的抑制率实测值、加和计算值及差值柱状图(注：图中编号参照表1)Fig. 3 The histograms of inhibition rate of 23 typical pesticide and veterinary drug binary combinations on CYP3A4 activity under 3 times standard mass concentration (a), standard mass concentration (b), and 0.5 times standard mass concentration (c), respectively(Note: The number of each pesticide and veterinary drug refer to Table 1)

3 个质量浓度梯度下均为拮抗作用的农兽药共9 个组合，其中毒死蜱 + 咪鲜胺 (2 + 19)、啶虫脒 + 哒螨灵 (16 + 12) 及苯醚甲环唑 + 烯酰吗啉(21 + 20) 的拮抗作用最为显著，均在3 倍标准质量浓度时达到最高，分别为64.6%、44.7%和28.2%；恩诺沙星 + 氟苯尼考 (27 + 22)、环丙沙星 + 氟苯尼考 (26 + 22)、联苯菊酯 + 啶虫脒 (8 + 16) 及吡虫啉 + 苯醚甲环唑 (17 + 21) 的拮抗作用较为明显，在0.5 倍标准质量浓度时，分别为27.5%、19.9%、18.6%和18.6%；吡虫啉 + 烯酰吗啉 (17 +20) 及乐果 + 烯酰吗啉 (4 + 20) 的拮抗作用较弱，均在5%以下。氯氰菊酯 + 烯酰吗啉 (10 + 20) 及毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯 (2 + 11) 在标准质量浓度和0.5 倍标准质量浓度时的协同或拮抗作用较弱，而3 倍标准质量浓度时有较强的拮抗作用，分别为25.8%及18.2%。

通过对比具有协同作用的组合可以看出，克百威或多菌灵单独作用于CYP3A4 酶时，无活性抑制作用，吡虫啉的抑制率也较低，这3 个农药的两两组合对CYP3A4 酶显示出10%～20%的抑制率，协同作用明显。所有含有克百威或多菌灵的二元组合，对CYP3A4 酶毒性均具有增强现象，协同作用最高可达20.7%。

2.3 26 种典型的农兽药三元组合对CYP3A4 酶联合毒性的测定

测定结果如图4 所示：大部分组合的联合毒性呈拮抗作用，3 种质量浓度梯度下均为协同作用的只有6 个组合，所占比例为23.1%。其中氯氰菊酯 + 啶虫脒 + 烯酰吗啉 (10 + 16 + 20)、克百威 +啶虫脒 + 多菌灵 (6 + 16 + 18) 的协同作用最为显著，分别为29.9%和21.6%；吡虫啉 + 啶虫脒 +多菌灵 (17 + 16 + 18)、吡虫啉 + 啶虫脒 + 烯酰吗啉 (17 + 16 + 20)、毒死蜱 + 啶虫脒 + 多菌灵 (2 +16 + 18)、联苯菊酯 + 啶虫脒 + 多菌灵 (8 + 16 +18) 4 种组合的协同作用较为显著，分别最高达15.4%、12.8%、12.1%和7.3%。氯氰菊酯 + 吡虫啉 + 烯酰吗啉 (10 + 17 + 20)、啶虫脒 + 哒螨灵 +虫螨腈 (16 + 12 + 13) 2 个组合在标准质量浓度和0.5 倍标准质量浓度时的协同作用为5.3%和10.5%；恩诺沙星 + 环丙沙星 + 土霉素 (27 + 26 + 30) 组合在3 倍标准质量浓度和标准质量浓度时的协同作用达到7.5%；吡虫啉 + 多菌灵 + 苯醚甲环唑 (17 +18 + 21) 组合在3 倍标准质量浓度下具有17.3%的协同作用；吡虫啉 + 异菌脲 + 烯酰吗啉 (17 + 15 +20) 组合在0.5 倍标准质量浓度下显示4.1%协同作用。

图4 26 种典型的农兽药三元组合分别在3 倍标准质量浓度 (a) 、标准质量浓度 (b) 、0.5 倍标准质量浓度梯度 (c)下对CYP3A4 酶活性的抑制率实测值、加和计算值及差值柱状图(注：图中编号参照表1)Fig. 4 The histograms of inhibition rate of 26 typical pesticide and veterinary drug ternary combinations on CYP3A4 activity under 3 times standard mass concentration (a), standard mass concentration (b) and 0.5 times standard mass concentration (c) respectively(Note: The number of each pesticide and veterinary drug refer to Table 1)

3 种质量浓度梯度下均为拮抗作用的农兽药组合共15 种，所占比例为57.7%。其中多菌灵 + 毒死蜱 + 咪鲜胺 (18 + 2 + 19)、氯氰菊酯 + 苯醚甲环唑 + 烯酰吗啉 (10 + 21 + 20)、苯醚甲环唑 + 多菌灵 + 毒死蜱 (21 + 18 + 2)、苯醚甲环唑 + 多菌灵 +氯氰菊酯 (21 + 18 + 10) 和多菌灵 + 毒死蜱 + 氯氰菊酯 (18 + 2 + 10) 5 种组合的拮抗最为显著，最高均可达50%以上，分别为73.5%、73.4%、71.2%、61.2%和56.2%；高效氯氟氰菊酯 + 苯醚甲环唑 +烯酰吗啉 (11 + 21 + 20)、吡虫啉 + 苯醚甲环唑 +烯酰吗啉 (17 + 21 + 20)、氯氰菊酯 + 啶虫脒 +哒螨灵 (10 + 15 + 12) 和多菌灵 + 毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯 (18 + 2 + 11) 4 种组合的拮抗作用比较明显，最高均可达30%以上，分别为42.3%、41.6%、37.6%、30.1%；恩诺沙星 + 环丙沙星 + 氟苯尼考(27 + 26 + 22)、多菌灵 + 毒死蜱 + 吡虫啉 (18 + 2 +17)、啶虫脒 + 哒螨灵 + 烯酰吗啉 (16 + 12 + 13)和吡虫啉 + 啶虫脒 + 苯醚甲环唑 (17 + 16 + 21) 4 种组合的拮抗作用较强，最高均在10%以上，分别为24.5%、16.5%、14.6%和18.1%；克百威 + 毒死蜱 + 多菌灵 (6 + 2 + 18)、联苯菊酯 + 啶虫脒 +虫螨腈 (8 + 16 + 13) 2 种组合的拮抗作用较弱，均在5%以下。

通过对比具有协同作用的组合可以看出，所有含有啶虫脒 + 多菌灵 (16 + 18) 的三元组合在3 种质量浓度梯度下对CYP3A4 酶均具有毒性增强现象，协同作用最高达21.6%。对比具有拮抗作用的组合可以发现，除了吡虫啉 + 多菌灵 + 苯醚甲环唑 (17 + 18 + 21) 在3 倍标准质量浓度下具有协同作用外，所有存在苯醚甲环唑 (21) 的组合在3 种质量浓度梯度下均存在毒性降低现象，拮抗作用最高达73.4%。

3 讨论

在单一农兽药对CYP3A4 酶活性抑制率的测试中，毒死蜱、咪鲜胺和哒螨灵对CYP3A4 酶的毒性最大，在0.5 倍设定的标准质量浓度即可分别达50.1%、42.2%和32.6%的抑制率，应慎重使用这3 种农药，以减少潜在的风险。在二元农兽药组合对CYP3A4 酶的联合毒性测试中，3 种质量浓度梯度下均为拮抗作用的组合共9 种，均为协同作用的共4 种，其中毒死蜱 + 高效氯氟氰菊酯组合的拮抗作用和克百威 + 多菌灵的协同作用与李静等[30]的测试结果相似，毒死蜱 + 克百威组合的协同作用与苟练等[31]的测试结果相似，苯醚甲环唑 + 烯酰吗啉、氯氰菊酯 + 烯酰吗啉2 个组合的拮抗作用与王天彩等[32]在低效应下的测试结果相似，啶虫脒、多菌灵和克百威3 种农兽药任意两两混合时存在毒性增强现象与王昕璐[33]的测试结果相似。在三元农兽药组合对CYP3A4 酶的联合毒性的测试中，3 种质量浓度梯度下联合毒性均为拮抗作用的组合共15 组，均为协同作用的组合共6 组，其中氯氰菊酯 + 啶虫脒 + 烯酰吗啉组合的协同作用与王天彩等[32]在低毒性效应区的测试结果相似。在已报道的文献中，关于农兽药三元组合联合毒性的测试实例较少，应作为今后研究重点。

农兽药的毒性与其化学结构之间存在着密切关系。研究农兽药化学结构及其毒性效应之间的关系，找出其规律，在毒理学研究中具有重要意义。基于单一农兽药与CYP3A4酶之间的构效关系分析，具有3 个芳氯基团的农兽药对CYP3A4酶活性的抑制作用最为显著，如百菌清、毒死蜱、甲基毒死蜱及咪鲜胺的抑制率在标准质量浓度时均达30%以上；具有2 个芳氯或“强吸电子基团 + 1 个芳氯基团”的农兽药对CYP3A4 酶活性的抑制作用较为显著，如苯醚甲环唑、哒螨灵和异菌脲的抑制率在标准质量浓度时均达18% 以上。WANG 等[34]在检测氯代甲烷对小麦叶绿素和土壤呼吸率的影响时同样发现，甲烷中氢原子被取代的越多，其毒性越大。这些研究结果表明农兽药毒性与卤代烃类卤素数之间可能具有一定的联系。

从农兽药多元组合对CYP3A4 酶的联合毒性的测试结果中可以看出：含有氨基甲酸酯结构的农兽药在本身对CYP3A4 酶毒性较小或几乎没有毒性时，与其他农兽药混合后存在较强的协同作用，如克百威和多菌灵单剂对CYP3A4 酶活性无抑制作用，而所有含有克百威或多菌灵的二元组合均存在较强的协同作用。有研究表明，含有氨基甲酸酯结构的农兽药具有较强的增效作用[35-36]，这可能是由于农兽药混合后，含有氨基甲酸酯结构的农兽药对酶具有激活作用或者可以防止与其混配的农兽药失活，从而使混合农兽药对酶活性的抑制效果增强，进而毒性增强所致。

当农兽药单剂对CYP3A4 酶活性的抑制率较高时，如苯醚甲环唑、咪鲜胺、毒死蜱等，与其他农兽药混合后联合效应呈拮抗作用；当农兽药单剂对CYP3A4 酶活性抑制率低于2%时，与其他农兽药混合后的联合毒性效应呈现不确定性，如啶虫脒、吡虫啉和恩诺沙星等农兽药与其他农兽药混合后，协同或拮抗作用均有存在。农兽药单剂在对CYP3A4 酶活性抑制率较高或较低时，其联合毒性效应呈现不同的情况，分析其原因可能是这些农兽药在以CYP3A4 酶为作用靶点时，其作用机制相似或相互影响，当某种农兽药对CYP3A4 酶活性抑制作用较强时，会影响甚至削弱其他农兽药对CYP3A4 酶的作用，从而产生更弱的毒性；而当某种农兽药对CYP3A4 酶活性抑制率较低时，作用机制之间的影响较弱或可以忽略不计，从而放大农兽药自身结构、理化性质、混合农兽药各组分之间的相互作用以及其他因素的影响，使得联合毒性效应呈现不确定性。从农兽药的浓度变化趋势可以看出，混合农兽药在低浓度下对CYP3A4 酶活性抑制率往往存在较强的毒性协同作用，但随着浓度的升高，联合毒性效应从协同变为拮抗作用。Nong 等[37]在检测抗生素与三唑类杀菌剂混合物对羊角月牙藻的联合毒性时同样发现，同一混合物在较高浓度区域呈拮抗作用，而在低浓度区域呈现协同作用。本研究中联合毒性效应显示随浓度变化而不同的原因可能是：低浓度下农兽药共同作用于同一位点，随着浓度的升高，混合农兽药中起决定作用的组分在对CYP3A4 酶的活性抑制过程中出现了不同的毒性效应或者类似竞争作用位点的可结合性降低，即“竞争性拮抗作用”[38]。

4 结论

本研究依据荧光探针技术和酶抑制法原理，建立了一种方便、快捷、高效的广谱筛查混合农兽药联合毒性效应的方法，探究了常用的30 种农兽药及其部分二元、三元组合在标准质量浓度、0.5 倍及3 倍标准质量浓度下的对CYP3A4 酶的联合毒性效应。农兽药结构中含有芳氯基团的数量与对CYP3A4 酶活性的抑制程度成正相关，含有芳氯基团越多对CYP3A4 酶的毒性越强。含有氨基甲酸酯结构的农兽药（包括克百威和多菌灵）在本身对CYP3A4 酶的毒性较小或几乎没有毒性时，与其他农兽药混合后显示较强的协同作用，在今后配制农兽药混剂时应慎重使用，以减少潜在风险。混合农药或兽药在低浓度下对CYP3A4酶往往存在较强的毒性协同作用，随着浓度的升高，联合毒性效应从协同变为拮抗作用。农兽药单剂对CYP3A4 酶活性的抑制率较高时，与其他农兽药混合后联合效应呈拮抗作用的组合较多；农兽药单剂对酶抑制率低于2%时，与其他农兽药混合后的联合毒性效应呈现不确定性。本研究建立的检测方法为广谱筛查混合农兽药联合毒性提供了新的思路，检测结果可为进一步在细胞和动物水平的农兽药混剂的风险评估方案设计提供依据。