双唑草腈对3 种水生生物的急性毒性及初级生态风险评估

孔玄庆, 蒋 煜, 罗泽伟, 喻 快, 成淑芬,欧阳文森, 李建明, 金晨钟, 欧晓明*,,

(1. 湖南化工研究院 国家农药创制工程研究中心/湖南省农用化学品重点实验室，长沙 410014；2. 湖南化研院检测技术有限公司，长沙 410014；3. 湖南人文科技学院/农田杂草防控技术与应用协同创新中心，湖南 娄底 417000)

农药作为重要的农用物资，在农业生产中起着至关重要的作用。然而，农药在施用过程中不可避免地会通过漂移、雨水冲刷、地表径流等多种途径进入水体中，发生一系列环境化学行为，有可能造成水生生态系统的污染[1]。残存于水体中的农药会对藻、溞、鱼、虾等水生生物产生影响[1-2]。

双唑草腈 (pyraclonil) 是德国拜耳公司于1992 年研制的一种双吡唑类除草剂，主要登记用于水稻田防除稗、千金子、异型莎草、鸭舌草、多花水苋等多种杂草，且对作物安全[3-5]，已在我国水稻种植区广泛使用。目前关于双唑草腈对环境影响的研究主要集中于其在土壤中的降解行为。例如，张月等[6]研究发现，双唑草腈在水体中半衰期较长，但在水稻土中的消解半衰期仅10 d左右，且其消解速率与土壤中有机质、黏粒含量和土壤含水量呈正相关，因此在稻田淹水条件下施用时消解较快，残留期较短。他们随后的研究还证实，双唑草腈在土壤中的淋溶及其对地下水的潜在污染风险因土壤类型而异，其在黑土地区对地下水的污染风险较小，而在紫土和棕壤土地区的污染风险较大[7]。目前有关双唑草腈对水生生物毒性的报道相对较少。本团队前期研究发现，双唑草腈对非洲爪蟾蝌蚪为低毒，但对胚胎孵化具有一定的影响[8]；Takashi 等[9]研究了包括双唑草腈在内的不同作用方式除草剂对5 种藻类的影响，发现绿藻类对双唑草腈较为敏感；但均未进行系统性的风险评估。基于此，本研究在前期工作[8]基础上，参照经济合作与发展组织 (OECD) 推荐的方法[10-12]，测定了双唑草腈对水生生态系统中不同营养层级生物 (斜生栅藻Scenedesmus obliquus、大型溞Daphnia magna和斑马鱼Brachydanio rerio) 的急性毒性，并运用TOP-RICE 模型[13-14]评价了双唑草腈对水生生态系统[15]的环境风险，以期为该除草剂科学使用准则的制定和生态风险评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要仪器：LC-20A 型高效液相色谱仪 (HPLC，配二极管阵列检测器和化学工作站)及AUY220 型万分之一电子天平 (日本岛津公司)；XSP-2C-1 型生物显微镜 (上海光学仪器厂)；JPBJ-608 型溶氧测定仪 (上海仪电科学仪器股份有限公司)；YD200型水总硬度测定仪 (上海三信仪表厂)；STARTER 3C 型酸度计 (德国塞多利斯公司)。

药剂及试剂：双唑草腈 (pyraclonil) 原药，质量分数97.5%，安徽中山化工有限公司；99.0% 双唑草腈标准品，日本Kyoyu Agri 公司；甲醇 (色谱纯)、丙酮 (分析纯)、吐温-80 (化学纯)，购于国药集团化学试剂有限公司；曝气自来水、超纯水、ISO 标准稀释液和水生4 号培养基，系本实验室自制[10-12]。

1.2 供试生物

斜生栅藻Scenedesmus obliquus引种于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。在21～24 ℃、光周期L : D = 16 h : 8 h、照度4440～8880 lx 的振荡培养箱中，采用水生4 号培养基进行转接扩大培养。转接3 次后基本达到同步生长，选择培养72 h 的栅藻供试。

大型溞Daphnia magna引种于中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。选择在20 ℃ ± 2 ℃、光周期L : D = 16 h : 8 h 的人工气候箱中孤雌繁殖3 代以上，选择出生后6～24 h、健康活泼的幼溞进行试验。

斑马鱼Brachydanio rerio购于湖南省长沙市湘阳水族馆。在试验室于23 ℃ ± 2 ℃、光周期L :D = 16 h : 8 h 条件下驯养7 d 以上。驯养期间每天喂食1～2 次市售成品饵料，及时清除粪便及食物残渣，死亡率在5%以下为有效试验。于试验前24 h 停止喂食，试验期间不喂食。试验用鱼为体长2.0 cm ± 0.23 cm、体重 0.2077 g ± 0.0024 g 的健康活泼个体。

1.3 试验方法

1.3.1 水样中双唑草腈实际浓度检测 参照张月等[6]的液相色谱测定方法并稍作改进。斑马鱼和大型溞试验中，分别于暴露处理0 h 和试验结束时取水样过0.45 μm 滤膜后直接进行分析。藻类试验中，分别于暴露处理0 h 和72 h 时取30 mL 藻液，离心，上清液用30 mL 二氯甲烷萃取4 次，合并有机相于45 ℃水浴下真空旋蒸至近干，加入3 mL 甲醇，过0.45 μm 滤膜后进行分析。

色谱检测条件：PDAD 检测器；Inert Sustain C18不锈钢色谱柱 (150 mm × 4.6 mm，5 μm) ，柱温40 ℃；流动相V(甲醇) :V(水) = 55 : 45，流速1.00 mL/min；检测波长236 nm；进样量20 μL；外标法定量。在上述色谱条件下，双唑草腈的保留时间约为7.80 min。

所用方法的检测限 (LOD) 为2.00 × 10−7mg，双唑草腈的定量限 (LOQ)为1.00 × 10−2mg/L。

1.3.2 双唑草腈对斜生栅藻的急性毒性测定 参照OECD 推荐的藻类生长抑制法[10]。试验在250 mL三角瓶中进行，以水生4 号培养液为稀释液。依据预试验结果，确定双唑草腈系列质量浓度依次为1.00 × 10−2、1.20 × 10−2、1.44 × 10−2、1.73 × 10−2、2.07 × 10−2和2.49 × 10−2mg/L。同时设空白对照组和含与药液配制相同体积丙酮和吐温-80 的溶剂对照组。处理后置于23 ℃、照度8400 lx 的培养箱中培养。藻细胞初始浓度为 1.00 × 104个/L，每处理 3 个重复。于处理后0、24、48 及72 h 分别取样，采用血球计数板统计藻细胞浓度，记录各处理藻细胞增殖受抑制情况，求出不同暴露时间下的EC50值及其相应的95%置信限。试验期间环境温度为21.7～22.6 ℃，照度为7880～8 450 lx。

1.3.3 双唑草腈对大型溞的急性毒性测定 参照OECD 推荐的溞类活动抑制法[11]，采用静态染毒。试验在100 mL 玻璃烧杯中进行，以ISO 标准溶液为稀释液。依据预试验结果，确定双唑草腈系列质量浓度为10.0、12.0、14.4、17.3 和20.7 mg/L，同时设空白对照和含与药液配制相同体积丙酮和吐温-80 的溶剂对照组，每处理 4 个重复，每个重复投入10 只幼溞。试验期间不喂食，暴露24 h 和48 h 后观察大型溞的活动情况，以溞类大触角和刚毛不动弹为被抑制标志，记录被抑制溞数，采用概率单位法求出暴露24 h 和48 h 时的EC50值及95%置信限。试验体系pH 值为7.51～7.92，硬度153 mg/L (以CaCO3计)，溶解氧8.01～8.38 mg/L以上；光周期L : D = 16 h : 8 h，温度19.3～21.2 ℃。

1.3.4 双唑草腈对斑马鱼的急性毒性测定 参照OECD 推荐的方法[12]，采用静态染毒。试验在3000 mL 玻璃水族箱中进行，以曝气24 h 以上的自来水为稀释液。依据预试验结果，确定双唑草腈系列质量浓度为15.0、18.0、21.6、25.9 和31.1 mg/L，同时设空白对照和含与药液配制相同体积丙酮和吐温-80 的溶剂对照，每处理投入10 条斑马鱼。不设重复。试验开始后0、24、 48、72 及96 h 时记录各容器中试验鱼的死亡数，并观察中毒症状，及时捞出死鱼 (用镊子夹鱼的尾部，若无反应即认为已死亡)。采用概率单位法求出不同暴露时间的LC50值及其95% 置信限。试验体系pH 值为6.74～7.63，水中溶氧量为7.72～8.44 mg/L，水质硬度为132 mg/L (以CaCO3计)，光周期L :D = 16 h : 8 h，温度22.8～23.7 C。

1.4 生态风险评估方法

常用的生态风险评估方法有风险商(RQ，risk quotient) 法和概率生态风险评价(PERA，probabilistic ecological risk assessment) 法两种，分别用于表征污染物暴露对生态环境产生危害的严重程度和概率。本研究拟重点关注除草剂双唑草腈对我国不同水体生态影响的严重程度，故选择风险商法作为表征方法。具体评估方法参照NY/T 2882.2—2016《农药登记环境风险评估指南 第2 部分：水生生态系统》[15]进行，主要分为问题阐述、暴露分析、效应分析和风险表征4 个阶段，通过收集双唑草腈生态毒理、环境归趋、理化性质等方面的数据，采用TOP-RICE 模型进行运算，根据所得预测环境浓度 (PEC，mg/L) 与预测无效应浓度(PNEC，mg/L) 计算风险商 (RQ) 值。具体计算公式见式 (1) 和式(2) 。

根据RQ 值的大小判断双唑草腈的生态风险：RQ 值 < 1，表明风险可接受；RQ 值 > 1，表明存在不可接受的高风险。

1.5 数据处理

采用SPSS (V16.0) 统计软件中的Probit 回归方法对试验结果进行分析。以药剂浓度对数为自变量，死亡或抑制率值为因变量，进行线性回归，计算其回归方程、决定系数 (R2) 以及双唑草腈对3 种非靶标生物的急性毒性LC50/EC50值及其95%置信限。

2 结果与分析

2.1 试验药液中双唑草腈的浓度变化

采用HPLC 检测试验药液中双唑草腈的浓度，结果表明，在有效成分1.00 × 10−2～40.0 mg/L 范围内，双唑草腈质量浓度与其对应的峰面积响应值间呈良好的线性关系，线性回归方程为y= 47280x–84.08，R2= 0.9999。分别采用大型溞、斑马鱼和斜生栅藻试验中所用培养溶液配制双唑草腈质量浓度为10.0 和25.0 mg/L、15.0 和40.0 mg/L 以及1.00 × 10−2和5.00 × 10−2mg/L 的标准工作溶液，进行添加回收试验，每个浓度重复5 次，测得双唑草腈在3 种培养溶液中的回收率为95.50%～100.98%，相对标准偏差 (RSD) 为0.49%～1.89%，表明所用方法符合检测分析的基本要求[16]。

典型色谱图见图1。试验过程中实测的双唑草腈质量浓度与初始 (0 h) 实测质量浓度相比变化率小于20%，说明双唑草腈在试验期间比较稳定，对照组中均未检测出双唑草腈 (表1)，因此，本研究可用实测的双唑草腈初始质量浓度代替试验过程中的实际质量浓度，用于计算双唑草腈对3 种水生生物的急性毒性效应 (EC50/LC50) 值。

表1 各试验体系中双唑草腈的实测浓度Table 1 Measured concentrations of pyraclonil in each test system

图1 大型溞试验中双唑草腈为20.7 mg/L 时的色谱图(48 h)Fig. 1 Liquid chromatogram of pyraclonil with 20.7 mg/L in the acute toxicity test of D. magna (48 h)

2.2 双唑草腈对水生生物的急性毒性

急性毒性试验过程中，空白对照和溶剂对照组3 种水生生物均状态良好，未发现明显受抑制现象。随药剂暴露浓度升高，3 种水生生物的死亡率及被抑制率均逐渐增大。在双唑草腈暴露胁迫下，斜生栅藻藻液较空白对照出现变黄或变浅现象，藻细胞分裂与生长受到抑制，其中生物量抑制率最高值(90.79%) 出现在最高浓度处理组暴露后72 h 时，但其相应的生长抑制率却低于50%；大型溞活动明显受到抑制，沉于水底；部分斑马鱼出现沉底、躁动、运动失衡或运动缓慢现象，部分死亡斑马鱼胸鳍和腹鳍处出现充血。研究表明，双唑草腈对3 种水生生物的抑制效应或致死效应随暴露时间延长和药剂浓度增高而表现出良好的暴露时间-质量浓度-效应关系。

双唑草腈对3 种水生生物的急性毒性LC50值或EC50值均随着暴露时间的延长而降低 (表2)。试验结束时，双唑草腈对斜生栅藻的72 h-EC50值为1.44 × 10－2mg/L，对大型溞的48 h-EC50值为15.09 mg/L，对斑马鱼的96 h-LC50值为23.05 mg/L。根据我国《化学农药环境安全评价实验准则》[17]中的毒性等级划分标准，双唑草腈对斜生栅藻为高毒，对大型溞和斑马鱼为低毒。

表2 双唑草腈对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼和的急性毒性Table 2 The acute toxicity of pyraclonil to S. obliquus, D. magna and B. rerio

2.3 风险评估

2.3.1 双唑草腈对水生生态系统的初级暴露分析

根据表3 中的相关数据，采用TOP-RICE 模型对双唑草腈进行暴露分析，当数据不相同或为范围数据时，遵循风险最大化原则进行运算。参照毛连纲等[14]的研究，由于 TOP-RICE 模型目前仅设定了喷雾的施药方式，与喷雾相比，撒施的叶面截留和漂移均较低，因此在模型运算中，设施药漂移率为“0”，设作物选项卡中的冲刷因子为最小值 (1.0 × 10−6)。经查询中国农药信息网[18]，目前我国登记有效期内的双唑草腈制剂仅1 个，防治对象为水稻田中的一年生杂草，最高施药剂量为有效成分0.21 kg/hm2，每季作物施药1 次，于人工插秧后5～7 d 撒施，抛秧或机插后8～10 d撒施。另根据国家水稻研究中心划分的水稻生育期，施药时间为水稻分蘖期 (BBCH20-29 时期) ，在该模型的连平场景点中，早稻为4 月20 日至5 月10 日，晚稻为7 月22 日至8 月13 日，南昌场景点中，早稻为4 月28 日至5 月17 日，晚稻为7 月17 日至8 月8 日。通过模型运算所得不同类型的 PEC 结果见图2。连平场景中，晚稻的地表径流PEC 值、池塘水PEC 值和暴露时间加权PEC 值均低于早稻，并且晚稻的模型输出PEC 值出现了部分为0 mg/L 的情况；南昌场景中，晚稻的地表径流PEC 值高于早稻，但晚稻的模型输出池塘水PEC 值和暴露时间加权PEC 值均低于早稻。

图2 不同场景点双唑草腈的预测环境浓度Fig. 2 PEC of pyraclonil under different scenarios

表3 双唑草腈的理化性质及环境归趋数据Table 3 Physicochemical properties and environmental fate data of pyraclonil

2.3.2 双唑草腈对水生生态系统的初级效应分析

通过本研究获得双唑草腈对3 种水生生物的急性毒性数据，结合相应的 UF 值，计算得到双唑草腈对水生生态系统中各类生物的 PNEC 值(表4)。

表4 双唑草腈的急性毒性数据Table 4 Acute toxicity data of pyraclonil

2.3.3 双唑草腈对水生生态系统的风险表征 利用TOP-RICE 模型，分别就双唑草腈对连平和南昌场景中早、晚稻的风险进行评估。分别选择地表径流PEC 值、池塘水PEC 值和时间加权平均PEC 值与效应分析中的PNEC 值计算RQ，得到各场景不同类型 PEC 值下RQ < 1 的占比结果 (表5)。对初级生产者而言，在连平-早稻场景中，无论以哪种类型的PEC 值进行风险表征，其RQ 值均大于1；在其他各场景中，RQ > 1 的占比也均超过60%；因此，无论以哪种类型的 PEC 值进行风险表征，双唑草腈对初级生产者的风险在各场景中均为不可接受，且其对早稻场景下的风险高于晚稻。针对无脊椎动物 (大型溞) ，在连平-早稻场景中同样以地表径流PEC 值进行风险表征，得RQ <1 的组占33.33%，其风险不可接受；以池塘水和时间加权PEC 值进行表征，则所有场景中的RQ值均小于1。对脊椎动物 (斑马鱼) 而言，在连平-早稻场景中，以地表径流PEC 值进行风险表征，RQ < 1 的组仅占42.86%，其风险为不可接受；在其他各场景中，以不同类型的PEC 值进行表征，其RQ < 1 的占比均超过60%，其中以池塘水PEC 值和时间加权PEC 值进行风险表征，所有场景中的RQ 值均小于1。

表5 不同预测环境浓度下双唑草腈RQ < 1 的占比分布Table 5 Proportion of RQ < 1 of pyraclonil to organisms under different PECs %

综合各场景的水生生态RQ 值进行整体评价，发现双唑草腈对3 种水生生物的RQ 值分布趋势基本一致：以地表径流PEC 值进行评估时所得RQ 值跨度最大，以池塘水PEC 值和时间加权PEC 值进行评估时RQ 值分布较为集中 (图3)。具体数据分析见表6。其中，针对双唑草腈对初级生产者 (斜生栅藻) 的风险评估中，分别以地表径流、池塘水和时间加权PEC 值进行风险表征，其RQ 最大值、平均值及第60 百分位值均远大于对脊椎动物 (斑马鱼) 和无脊椎动物 (大型溞) 的 RQ值。而在采用不同类型的3 种PEC 值对水生生态系统中不同营养层级生物进行的风险评估中，均以采用地表径流PEC 值进行评估所得风险最大，其RQ 最大值、平均值以及第60 百分位值均远大于其他两种类型，而以采用时间加权PEC 值进行评估时所得风险最小。

图3 不同预测环境浓度下双唑草腈对3 种水生生物的风险商Fig. 3 RQs of pyraclonil to D. magna, B. rerio and S. obliquus under different PECs

表6 不同预测环境浓度下双唑草腈的风险商值分析Table 6 Analysis of RQs under different PECs

3 结论与讨论

藻类、溞类和鱼类分属于 3 个不同的营养层级，是水生生态系统的重要组成部分，同时也是目前水生生态毒理学研究的主要试验生物类群，被广泛用于水生生物安全性评价中。根据农药对斜生栅藻、大型溞和斑马鱼的急性毒性等级划分标准[17]，本研究结果表明，双唑草腈对大型溞和斑马鱼为低毒，其急性毒性48 h-EC50值和96 h-LC50值分别为15.09 mg/L 和23.05 mg/L，而对斜生栅藻表现为高毒，其72 h-EC50值为1.44 ×10−2mg/L，与前人的研究结果[8-9,20]一致。瞿晶菁等[23]的研究证实，双唑草腈对大鼠脑、心、肺、肝、肾、睾丸、附睾、卵巢和子宫等各脏器均未引起明显病理形态学改变，说明其对动物较为安全。已有研究证明，绿藻对原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂最为敏感[9]，本研究表明，双唑草腈对斜生栅藻的毒性较高，其原因也可能是由于该类除草剂的作用靶标是普遍存在于斜生栅藻和植物叶绿体中的原卟啉原氧化酶，但有关双唑草腈对藻类的具体致毒机理尚待更深层次研究。

农药环境风险评估是评价在特定使用条件下农药对人类和环境造成伤害的可能性，不仅需要考虑农药本身的毒性，还需考虑实际使用条件下评估对象对农药的接触和暴露程度，目前我国农药登记中对风险评估的要求也不再依据单一的毒性评估，而是同时包括了暴露评估和不确定性评估。此外，农药环境风险评估也是量化农药生态风险的重要手段，可通过研究农药施用对非靶标生物的暴露及对生态系统结构和功能所造成的影响，阐明和预测农药对环境的潜在危害，进而提出相应的风险管理措施[24-25]。本研究采用TOPRICE 模型结合风险商值法，就目前我国水稻上登记使用的双唑草腈产品对水生生态系统的风险进行了评估，结果显示，在现有登记情况下，不同场景点中双唑草腈对脊椎动物和无脊椎动物的风险均在可接受水平，而对初级生产者的风险为不可接受，其RQ 值高达618.52，远大于风险划分值1，且在连平、南昌两个场景中均为早稻时期施药风险更高。因此，在实际生产中应注意科学合理用药，做好隔断措施，以防止双唑草腈流入附近的池塘和沟渠，同时应合理调整施药时期，以降低其对初级生产者的风险：在连平和南昌场景中，于早稻分蘖前期施用双唑草腈，其PEC 值较低，虽可适当降低风险，但其RQ 值仍大于1，风险仍不可接受；于连平场景晚稻分蘖中后期施用，RQ 值小于1 的占比有所增加；于南昌场景晚稻分蘖后期施用，则其风险均可接受。然而，有关施药时间改变是否会影响双唑草腈对杂草的防效尚待进一步研究。

本研究在测试双唑草腈对藻类、溞类和鱼类急性毒性的基础上，采用TOP-RICE 模型预测得到双唑草腈在连平和南昌早稻和晚稻两个场景中的暴露浓度，再运用RQ 法评估了其水生生态风险，所得结果可为该药剂的环境安全性评价及合理使用提供依据，但本研究中仍存在一些可能导致结果产生偏差的因素：首先TOP-RICE 模型中只设定了喷雾法，而双唑草腈的施药方式为撒施，因此在模型数据输入中对相关数据进行了调整；其次因无法获得双唑草腈代谢物的毒理学数据，在关于水生生态系统和地下水 PEC 值的运算中仅采用母体的毒性数据进行了初级风险评估，因而其代谢产物的风险未能体现出来；此外，本研究仅根据理论喷雾施药情形进行了预测评价，其结果与实际使用情况可能会存在一定差异。因此，在后续应采用田间残留消解研究结果和实际监测数据，进一步开展双唑草腈对初级生产者的高级风险评估，以确保评估结果的准确性和指导意义。