QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定中药材水蛭中73 种农药残留

郑坤明

(1. 福建中检华日食品安全检测有限公司，福州 350028；2. 贵州大学 精细化工研究开发中心，绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地和教育部重点实验室，贵阳 550025)

中药材水蛭H i r u d o 为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman 或柳叶蚂蟥Whitmania acranulataWhitman 的干燥体[1]。目前，关于中药材中农药残留检测的前处理方法多采用液-液萃取、固相萃取、凝胶渗透色谱等[2-5]。这些方法需要特殊的设备、大量的溶剂，且前处理繁琐、成本较高，从而限制了中药材中农药痕量分析的快速检测。QuEChERS 方法自从2003 年被Anastassiades等[6]建立以来，因为其具有快速、简便、廉价、有效、耐用、安全等特点而成为农药残留检测的热点，被广泛应用于食品中农兽药的残留检测。经后期改进，美国和欧洲标准委员会已将QuEChERS方法作为官方分析方法[7]。针对中药材中农药残留检测方法多采用气相色谱法[8-9]、气相色谱 -质谱法[10-11]和液相色谱-串联质谱法[12]，这些方法检测对象主要是植物源性中药材，而采用气相色谱-串联质谱检测动物源性中药材中农药多残留的方法尚未见报道。目前《中国药典》中尚无关于水蛭中农药残留的测定方法，而文献报道主要集中在有机氯类农药，其采取的净化手段主要有固相萃取和磺化，检测仪器为气相色谱[13-15]。这些方法研究的对象比较单一、前处理复杂、采用的气相色谱抗干扰性差、易出现假阳性的概率，且无法同时检测不同类别的农药。本文选取稻田中常用的农药，利用改进的QuEChERS 净化技术，同时结合串联质谱仪选择性高、抗干扰能力强的特点，建立了QuEChERS-气相色谱-串联质谱(GCMS/MS)同时测定中药材水蛭中73 种农药残留的分析方法，旨在为水蛭中农药多残留的快速检测提供实用性分析技术。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂、材料

Agilent 8890-7000D 气相色谱-串联质谱仪(安捷伦科技有限公司 )；低速离心机(德国Sigma 公司)；MTV-100 型多管漩涡混合仪(杭州奥胜仪器有限公司)；QL-901 型涡旋混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)；TGL-20B 型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。73 种农药标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司；乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA，安谱科技有限公司)；十八烷基键合硅胶(C18，安谱科技有限公司)；所用的试剂均为分析纯或色谱纯；试验用水为三重过滤去离子水。

水蛭为福州市各药店抽检样品(主要来源于湖南、安徽、江苏)。

1.2 样品前处理

称取500 g 水蛭样品，粉碎，过450 μm 筛，准确称取5 g (精确至0.01 g)于50 mL 聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL 超纯水涡旋30 s 后浸泡30 min，加入10 mL 的V(1%乙酸) :V(乙腈) =1 : 99溶液、1 g 氯化钠、5 g 无水硫酸镁、1.5 g 乙酸钠及1 颗陶瓷均质子，剧烈振荡2 min，于4 000 r/min 下离心5 min；取5 mL 上清液于10 mL 离心管(150 mg PSA、150 mg C18，500 mg 无水硫酸镁)中，涡旋振荡2 min，于15000 r/min 下离心5 min；取2 mL 上清液氮吹干后，用1 mLV(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 溶液复溶，待测。

1.3 GC-MS/MS 仪器检测条件

色谱条件：HP-5 MS 色谱柱(Agilent，30 m ×250 μm, 0.25 μm)；载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)；进样口温度280 ℃；进样量1μL；脉冲不分流进样；流速2.0 mL/min；程序升温：60 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升温至140 ℃，再以15 ℃/min 升温至250 ℃，最后以20 ℃/min 升温至300 ℃保持5 min。

质谱条件：带拉出极的电子轰击离子源(Xtr-EI)；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；碰撞气为高纯氮气(纯度 ≥ 99.999%)；淬灭气为高纯氦气(纯度≥ 99.999%)；溶剂延迟时间5.0 min；动态多反应监测模式(dMRM)。质谱参数见表1。

1.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

标准储备液：准确称取一定质量的73 种农药标准品，用丙酮溶解，配制成不同浓度的标准储备液，于−18 ℃保存。分别吸取不同体积的标准储备液，用丙酮稀释，配制成10 mg/L 的73 种农药混合标准储备溶液，于−18 ℃保存。

基质匹配标准工作溶液：按照 1.2 节的方法提取样品，得到水蛭空白样品提取液。用水蛭空白样品提取液稀释73 种农药混合标准储备溶液，配制成10.0、50.0、100、200、400 和500 μg/L 的系列基质匹配标准溶液，按1.3 的条件进行检测。以其质量浓度为横坐标(x, μg/L)，定量离子峰面积为纵坐标(y) 绘制标准曲线，以3 倍信噪比计算73 种农药在基质中的检出限(LOD)，以最小添加水平为定量限(LOQ)。

1.5 基质效应

对于GC-MS/MS 来说，基质可降低进样口色谱柱等部位的活性位点的活性，减少了待测物与该活性位点的结合，使待测物可顺利通过气相色谱色谱系统到达检测器，从而减少了拖尾和降解的情况，因此表现出基质增强效应[16]。此外，基质成分和农药结构的差异也会导致基质效应的不同。本研究中按公式(1)计算基质效应 (Me) ，当Me在−20% 和20% 之间可以忽略基质效应的存在，否则不可忽略基质效应[17]。

式中，A1为水蛭基质的峰面积，A2为标准溶液的峰面积。

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱检测条件的优化

本文考察了DB-1701 MS 和HP-5 MS 两种色谱柱分析目标物的情况。结果表明：部分农药在DB-1701 MS 上的分离度不如在HP-5 MS 上的(如苯醚甲环唑)，故采用HP-5 MS 作为分离目标物的色谱柱。

关于三重四极杆的质谱条件一般包括母离子、子离子及其碰撞能的参数。取73 种农药的混合标准溶液自动进样，设置扫描范围m/z50～700进行MS1 全扫描，使用Agilent 提供的NIST17标准谱库进行确证目标物的保留时间，利用自动优化软件自行优化，确定特征离子碎片和碰撞能量。优化后的73 种农药的定量离子、定性离子及碰撞能量结果见表1，在动态多反应监测模式扫描下的总离子流图如图1 所示。

图1 73 种农药的总离子流图(0.05 mg/L)Fig. 1 Total ion chromatogram of 73 pesticides (0.05 mg/L)

表1 73 种农药质谱参数Table 1 Mass spectrum acquisition parameters of 73 pesticides

2.2 前处理条件优化

2.2.1 样品加水量的优化 为提高水蛭的浸润性并减少极性物质对目标物的干扰，加入适量水浸泡水蛭样品。考察了分别向5 g 水蛭中加入5、10、15 和20 mL 水浸泡对待测物回收率的影响。结果表明：随加水量增加，农药回收率呈先升高后降低的趋势变化，当加水量为10 mL 时，大部分农药的回收率在70%～110% 之间，因此选定5 g 水蛭中加水量为10 mL。

2.2.2 提取溶剂的选择 乙腈不仅适用极性范围相对广泛的农药且以饱和盐析效应加入氯化钠促使水相和有机相分层，不用后期进行除水[18-20]。参照AOAC 提取方法，向含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液中加入1.5 g 乙酸钠作为缓冲体系，可以使提取溶液的pH 值在5.5～6.0 之间。结果表明：单纯以乙腈作为提取溶剂时，异菌脲等农药在水蛭中的回收率较低，但加入缓冲体系时，所有农药的回收率均能满足要求，故选择提取溶剂为[V(乙酸) :V(乙腈) = 1 : 99]和1.5 g 乙酸钠缓冲溶液。

2.2.3 净化剂的选择 传统的QuEChERS 吸附剂常用的净化剂有PSA、GCB、C18和MgSO4。PSA 可用于除去样品中的有机酸、脂肪酸和糖类等物质从而减少基质效应，但对含羟基、氨基、巯基等官能团的农药会因形成氢键作用导致提取效率偏低[21]，而作为含有长烷基链的C18，对脂溶性农药和蛋白质有一定的吸附作用[22]，故在水蛭中加入适量PSA 和C18可以减小干扰物对分析结果准确度的影响。水蛭的主要成分是脂肪酸和蛋白质，色素较少，故本研究不考虑用GCB 进行净化。在其他条件不变的情况下，向水蛭空白基质中加入0.04 mg/kg 的73 种农药混合标准溶液，以73 种农药添加回收率(试验重复3 次，取平均值)在70%～110%之间的农药个数来衡量试验结果，分别考察了50、100、150、200 和250 mg 的PSA 和C18对提取效率的影响。结果表明(图2)：随着PSA 用量的增加，处于70%～110%之间的农药个数随之增加，但超过200 mg 时，提取液的颜色逐渐变浅，回收率在70%～110%之间的农药个数也有所下降，这可能与PSA 含有两个氨基使其呈碱性，对部分具有酸性基团的有机磷农药有一定吸附有关。同样地，随C18用量的增加，回收率在70%～110% 的农药个数也增加，但过多的C18会吸附部分脂溶性农药，导致回收率在70%～110%的农药个数也有所下降。当PSA 和C18的用量均为100 mg 时，所有农药虽可满足检测标准的要求，但用量增加到150 mg 时，回收率处于70%～110%的农药数量更多，故选用150 mg PSA和150 mg C18作为净化剂。

图2 不同吸附剂组成对提取回收率(70%～110%)的影响Fig. 2 Recoveries (70%-110%) of pesticides using different amounts of sorbents in the purification process

2.2.4 复溶溶剂的优化 对于气相质谱来说，一般采用易挥发的溶剂作为复溶溶液，因为乙腈对弱极性的色谱柱有一定的伤害性且其沸点较高，在程序升温时需较高的初始温度，最终导致试验的重复性较差，所以须对复溶溶液进行转换。考察了沸点相对较低的乙酸乙酯、丙酮、V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 分别作为复溶溶液对试验结果的影响。结果表明(图3)：当采用V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 进行复溶时，溶解出来的杂质较少。而用乙酸乙酯和丙酮复溶时，溶解出来的杂质较多，对仪器会造成污染。故用V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 作为复溶溶液。

图3 3 种复溶溶剂对水蛭空白样品的全扫描总离子流色谱图Fig. 3 The full scan total ion current chromatograms of the blank Hirudo sample in three different solvents

2.3 方法评价

2.3.1 方法的线性范围、检出限、定量限与基质效应 结果显示，在10.0～500 μg/L 范围内，73种农药的质量浓度与其峰面积间呈良好的线性关系，相关系数(r)均 > 0.99，73 种农药的检出限为0.001～0.008 mg/kg，定量限为0.02 mg/kg。73 种农药中，部分有机磷农药表现出轻微的基质效应(0.7～20.3)，水胺硫磷、对硫磷和杀螟硫磷等7 种有机磷农药表现为中等增强基质效应(22.4～38.4)，倍硫磷及其代谢物倍硫磷砜和倍硫磷亚砜表现为基质抑制效应(−27.6～−39.8)，而菊酯类农药如高效氯氟氰菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯等存在基质增强效应(28.4～102.9) (表2)。因此本研究采用基质匹配标准曲线进行定量分析，以提高分析结果的正确度和精密度。

2.3.2 方法的正确度与精密度 往水蛭空白样品中添加0.02、0.04 和0.2 mg/kg 3 个水平的农药混合标准溶液，每个水平重复6 次，按优化后的条件测定，结果如表2 所示，从中可看出，73 种农药回收率范围在71%～117%之间，RSD 为1.1%～12%。表明该方法的正确度、精密度较高，可用于测定样品中多种农药残留[23]。

表2 73 种农药在水蛭中的检出限、平均回收率及相对标准偏差Table 2 LOD, average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 73 pesticides in Hirudo

续表2Table 2 (Continued)

2.4 实际样品的检测

从福州市区大型药店随机抽取20 批市售干燥的水蛭样品(主要来源于湖南、安徽、江苏)，应用本研究建立的方法进行检测。结果发现：有3 个批次样品中检出氯氰菊酯，检出值分别为0.023、0.034 和0.043 mg/kg，1 个批次样品中同时检出氯氟氰菊酯和溴氰菊酯，检出值分别为0.028 和0.037 mg/kg，其余农药均未检出。目前，氯氰菊酯、氯氟氰菊酯和溴氰菊酯在水蛭中暂无MRL，参照GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》中氯氰菊酯和和氯氟氰菊酯在药用植物残留限量分别为2、0.05～2 mg/kg，参照NY 5070—2001《无公害食品 水产品中渔药残留限量》中溴氰菊酯限量要求不超过0.1 mg/kg，水蛭样品均未超标。菊酯的检出说明水蛭在人工养殖过程中可能由于土壤和水质受到污染，导致其在水蛭体内富集。因此建议加强对中药材水蛭中农药残留的监测，以便于中药材安全使用和管理。

3 结论

本研究通过对样品前处理方法和色谱-质谱条件的筛选与优化，建立了中药材水蛭中73 种农药残留量的QuEChERS-气相色谱-串联质谱检测方法。样品用V(乙酸) :V(乙腈) = 1 : 99 和1.5 g 乙酸钠溶液作为缓冲体系提取后，采用优化后的QuEChERS 方法进行净化，并在GC-MS/MS 的带拉出极的电子轰击离子源和动态多反应监测模式下检测，用基质匹配外标法定量。73 种农药的LOD 为0.001～0.008 mg/kg，LOQ 为0.02 mg/kg；在0.02、0.04 和0.2 mg/kg 添加水平下，73 种农药在水蛭中的回收率在71%～117%之间，相对标准偏差(RSD)在1.1%～12%之间。该方法简单快速、准确、灵敏度高、实用性强，符合残留检测的要求，适用于中药材水蛭中73 种农药残留量的快速检测。