QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法检测吡噻菌胺、肟菌酯及代谢物在番茄中的残留及长期膳食风险评估

李若同, 胡继业

(北京科技大学 化学与生物工程学院，北京 100083)

番茄Lycopersicum esculentumMill. 在生产过程中易受到病虫危害，导致产量和品质下降，常见病害有灰霉病Botrytis cinerea和白粉病Uncicula necator[1]。吡噻菌胺 (penthiopyrad，结构式见图式1-a) 是一种新型的吡唑酰胺类杀菌剂，可有效防治番茄灰霉病和白粉病[2]。其作用机理是通过抑制琥珀酸脱氢酶来影响靶标菌的线粒体呼吸链电子传递，从而破环其活性[3]。研究表明，吡噻菌胺在早期对斑马鱼有急性毒性，并会在其发育过程中诱发一系列畸形[4]。吡噻菌胺在田间施用后的主要代谢物1-甲基-3- (三氟甲基) -1H-吡唑-4-甲酰胺 (PAM，结构式见图式1-b) ，其毒性比母体高[5]。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定吡噻菌胺监测定义为吡噻菌胺[6]，而农药残留联席会议JMPR (2012) 规定吡噻菌胺的评估定义为吡噻菌胺及其代谢物PAM 之和，以吡噻菌胺表示[5]。肟菌酯 (trifloxystrobin，结构式见图式1-c) 属甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其作用机理是通过阻止线粒体的电子传递链来抑制线粒体的呼吸作用[7]，具有杀菌谱广和耐雨水冲刷等特点，被广泛用于防治马铃薯、黄瓜、番茄和苹果等作物上的病害[8-9]。研究表明，肟菌酯对部分水生非靶标生物具高毒或剧毒[8]。肟菌酯在被植物吸收后，会产生代谢物肟菌酸 (trifloxystrobin acid，结构式见图式1-d)[10]。有研究表明，酸性代谢物具有更高的水溶性，有可能对生态环境中的有益的动植物群体造成伤害[9]。GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定，肟菌酯监测定义为肟菌酯[6]，而JMPR (2017)规定肟菌酯的评估定义为肟菌酯及其代谢物肟菌酸之和，以肟菌酯表示[10]。鉴于此，检测农作物中吡噻菌胺及其代谢物PAM 和肟菌酯及其代谢物肟菌酸的残留对维护膳食安全和环境安全至关重要。

图式1 吡噻菌胺 (a)、PAM (b)、肟菌酯 (c) 和肟菌酸 (d)的化学结构式Scheme 1 The structural formula of penthiopyrad (a),PAM (b), trifloxystrobin (c) and trifloxystrobin acid (d)

目前，关于吡噻菌胺残留的检测方法主要有固相萃取技术或QuEChERS 结合高效液相色谱法(HPLC) 、高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS) 以及气相色谱法 (GC)[3,11-14]，但大部分的研究仅限于对吡噻菌胺母体的检测，仅有一篇文献报道了吡噻菌胺和代谢物PAM 在紫苏叶上的同时检测[12]。关于肟菌酯及其代谢物肟菌酸的检测方法有HPLC-MS/MS、GC 和气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS) ，涉及番茄[8]、小麦[15]、西瓜[16]、咖啡[17]、水稻[18-19]和黄瓜[20]等作物。已有学者运用GC 建立了吡噻菌胺和肟菌酯在蜂蜜、苹果花和蜜蜂体内以及人血清中的检测方法[21-22]，但这些研究仅检测了吡噻菌胺和肟菌酯母体的残留量。综上所述，目前尚未见吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中残留同时检测的报道，且未见通过多地残留试验结果对吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的膳食风险进行评估的相关研究。

本研究依据NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》[23]在中国12 地开展了30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂 (吡噻菌胺10%，肟菌酯20%，单位g/100 g) 在番茄上施用的田间规范残留试验，利用QuEChERS-HPLC-MS/MS 法对吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄上的残留量进行分析，并结合田间残留试验结果、膳食结构和毒理学数据进行了吡噻菌胺和肟菌酯的膳食风险评估，旨在为30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂在番茄生产中的科学使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260HPLC-6460 MS/MS 液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 (美国Agilent 公司)；FA2504型电子天平 (0.0001 g) 和MP2002 型电子天平 (0.01 g)(上海恒平科学仪器有限公司)；QL-861 型涡旋振荡器 (其林贝尔仪器制造有限公司)；TG16B 型离心机 (湖南凯达科学仪器有限公司)。

100%肟菌酯 (trifloxystrobin) 和99.6%肟菌酸(trifloxystrobin acid) 标准品，购于北京勤诚亦信科技开发有限公司，99.9%吡噻菌胺 (penthiopyrad)和100%PAM 标准品，以及30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂 (30% suspension concentrate of penthiopyrad and trifloxystrobin，吡噻菌胺10%，肟菌酯20%) ，均由江苏龙灯化学有限公司提供；N-丙基乙二胺(PSA) ，购于天津博纳艾杰尔科技有限公司；石墨化碳黑 (GCB) ，购于南京先丰纳米有限公司；氯化钠和无水硫酸镁，购于国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈，购自迈瑞达科技有限公司；色谱纯甲酸，购自北京迪马科技有限公司；分析纯乙腈和乙酸，购自北京市通广精细化工公司。

1.2 田间试验

依据NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》[23]，30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂在番茄中的残留试验于2020 年在北京、宁夏银川、山东济南、贵州贵阳、河南永城、江苏南京、内蒙古呼和浩特、山西太原、上海松江、湖南长沙、广西南宁和福建福安12 地开展。试验设处理和对照小区，每小区面积50 m2，两个小区间设隔离区。30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂施药剂量为有效成分270 g/hm2，于番茄灰霉病发生初期喷雾施药2 次，施药间隔7 d (推荐的安全间隔期为5 d) 。分别于末次施药后5 和7 d 采用随机取样法采集番茄样本。每次在试验小区内至少12 株番茄植株的上、下、左、右采集24 个番茄果实2 份，每份不少于2 kg，除去果梗后用干毛刷除去表面尘土，用不锈钢刀沿纵向均匀地切成4 瓣，取不相邻的两瓣混匀，分取250 g 样本两份，于 −20 ℃保存，备用。除此之外，在北京、宁夏银川、山东济南和贵州贵阳4 个试验点于末次施药后间隔0 (2 h)及1、3 和10 d 也依照上述方法采集番茄样本。

1.3 残留分析方法

1.3.1 样品前处理 称取5 g (精确至0.01 g) 匀浆的番茄样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈和0.1 mL 乙酸，涡旋1 min，加入1 g 氯化钠和4 g 硫酸镁，涡旋30 s，于3000 r/min 下离心3 min；取1.5 mL 上清液，转移至预先加有PSA 20 mg、GCB 15 mg 和硫酸镁150 mg 的2 mL 离心管中，涡旋30 s，于10000 r/min 下离心3 min；取上清液，过0.22 μm 滤膜，待HPLC-MS/MS 检测。

1.3.2 HPLC-MS/MS 检测条件

色谱条件：Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱 (3.0 mm × 50 mm，2.7 μm) ，柱温为25 ℃；流动相为V(乙腈) :V(体积分数为0.2%的甲酸水溶液) =80 : 20，等度洗脱，分析时间为2 min；流速0.45 mL/min；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描 (ESI+) ，多反应监测模式 (MRM) ，干燥气温度350 ℃，流速12 L/min，雾化气压力275.8 MPa，毛细管电压4000 V。其他质谱条件见表1。

表1 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸质谱检测条件Table 1 Mass spectrometry parameters for penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid

1.3.3 标准溶液配制及标准曲线绘制 称取0.02 g(精确至0.0001 g) 吡噻菌胺或PAM 标准品，用乙腈溶解并定容至25 mL，配制成质量浓度为800 mg/L的标准储备液；称取0.01 g 肟菌酯或肟菌酸标准品，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1000 mg/L 的标准储备液。取适量的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸标准储备液，用乙腈稀释，配制质量浓度为100、50、35 和20 mg/L的系列混合标准工作溶液，于4 ℃保存，用于后续试验。

分别用番茄空白基质溶液和乙腈稀释20 mg/L的混合标准工作溶液，配制成质量浓度为0.025、0.1、0.25、1 和2 mg/L 的番茄基质匹配标准溶液和溶剂匹配标准溶液。按1.3.2 节的条件测定，分别以4 种化合物的进样质量浓度 (x) 为横坐标，相应的峰面积 (y) 为纵坐标，绘制4 种化合物基质匹配标准曲线和溶剂匹配标准曲线。

1.3.4 添加回收试验 添加水平的选择依据《农作物中农药残留试验准则》进行，为满足添加水平应包括最大残留限量(MRL)值和检测方法定量限的要求，分别以吡噻菌胺和肟菌酯对应的MRL 值作为吡噻菌胺和PAM 以及肟菌酯和肟菌酸的最高添加水平，以4 种化合物的LOQ 作为最低添加水平。选择中等添加水平时，采用相对分子质量折合的方式计算母体和代谢物各自对应的添加水平。计算公式见式 (1) 。

式中：MRL 为母体的MRL 值。C1和C2分别代表母体和代谢物的添加水平，M1和M2分别代表母体和代谢物的相对分子质量。

在空白番茄样品中添加3 个水平的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸混合标准工作溶液，每个水平重复5 次。空白番茄样品中吡噻菌胺和PAM的添加水平为0.05、0.7 和2 mg/kg，肟菌酯的添加水平为0.05、0.3 和0.7 mg/kg，肟菌酸的添加水平为0.05、0.4 和0.7 mg/kg，按1.3.1 节的方法进行样品前处理和和1.3.2 节的条件测定，计算添加回收率及相对标准偏差 (RSD) (n= 5) 。定义最低添加水平为方法的定量限 (LOQ，mg/kg) 。以3 倍信噪比对应的基质匹配标准溶液浓度定为仪器的检出限 (LOD，μg/kg) 。

1.3.5 基质效应 基质效应 (Me) 会导致试验的准确度下降。本研究中按公式 (2) 计算Me，当Me>0 时为基质增强效应，反之为基质减弱效应[24]。

式中：Sm为基质匹配标准溶液曲线斜率；Ss为溶剂标准溶液曲线斜率。

1.3.6 样品检测 按照本研究建立的方法对田间试验样品进行检测分析，明确吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄上的残留量情况。按公式(3) 计算吡噻菌胺 (吡噻菌胺和PAM 之和) 和肟菌酯 (肟菌酯和肟菌酸之和) 的残留量。每批检测样本均设置2 个质控样本。番茄样本中吡噻菌胺和PAM 的添加水平均为0.7 mg/kg，肟菌酯的添加水平为0.3 mg/kg，肟菌酸的添加水平为0.4 mg/kg。质控样品在每批实际样品之前进行检测。

式中：X为吡噻菌胺 (吡噻菌胺和PAM 之和)或肟菌酯 (肟菌酯和肟菌酸之和) 的残留量。X1和X2分别代表吡噻菌胺 (或肟菌酯) 残留量和PAM(或肟菌酸) 残留量。M1和M2分别代表吡噻菌胺(或肟菌酯) 的相对分子质量和PAM (或肟菌酸) 的相对分子质量。当任意一个成分的残留量小于LOQ 时，采用LOQ数值计算，若都小于LOQ，则表达为 < 2 × LOQ。

1.4 膳食风险评估

吡噻菌胺和肟菌酯的国家估算每日摄入量(NEDI) 按公式 (4) 计算。

式中：STMRi为目标化合物在番茄和中国已登记其他作物中的规范残留试验中值，mg/kg；对于若没有残留试验中值的登记作物，残留试验中值取相应的MRL 值，若中国没有相应的MRL 值，则取美国或欧盟等制定的MRL 值；Fi为中国一般人群的人均食品消费量，kg。

吡噻菌胺和肟菌酯的膳食摄入风险用NEDI占ADI 的百分率表示，即风险商 (RQ) 表示，按公式 (5) 计算。当RQ < 100%，表明膳食风险处于可接受范围，反之则表示风险不可接受，且数值越大风险越高[25]。

式中：ADI 为每日允许摄入量，mg/(kg bw)；bw 为中国消费者的平均体重 (63 kg) 。

2 结果与讨论

2.1 方法验证

由于4 种目标化合物较稳定，母体和代谢物之间很少甚至不发生相互转化，因此在空白番茄样品中添加3 个水平的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸混合标准工作溶液，按上述条件分析检测，添加回收试验结果 (表2) 表明：吡噻菌胺在番茄中的平均回收率在89%～97%之间，RSD ≤ 3.7%；PAM 在番茄中的平均回收率在88%～95%之间，RSD ≤ 3.5%；肟菌酯在番茄中的平均回收率在90%～95%之间，RSD ≤ 3.9%；肟菌酸在番茄中的平均回收率在89%～94%之间，RSD ≤ 3.6%。

表2 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中的平均添加回收率和相对标准偏差Table 2 The average recoveries and RSDs of penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in tomato

基质匹配标准曲线的结果 (表3) 表明：吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在0.005～2 mg/L范围内，番茄基质匹配标准溶液的质量浓度与其响应值间均呈良好的线性关系，R2> 0.9992。在上述仪器条件下，吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄基质中的定量限均为0.05 mg/kg，检出限均低于0.105 μg/kg。所建立的检测方法可满足《农作物中农药残留试验准则》的要求，适合用于吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中残留的分析研究。

吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中均表现为基质减弱效应 (表3)，为减少基质效应对方法准确度的影响，采用基质匹配标准曲线定量来消除基质效应造成的影响。

表3 吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸在番茄中的线性方程、定量限、检出限及基质效应Table 3 Linear equations, LOQ, LOD and matrix effects of penthiopyrad, PAM, trifloxystrobin and trifloxystrobin acid in tomato

每批检测样本均设置两个质控样本。在0.7 mg/kg 添加水平下，吡噻菌胺在质控样本中的回收率在87%～93%之间， PAM 在质控样本中的回收率在86%～91%之间；在0.3 mg/kg 添加水平下，肟菌酯在质控样本的回收率在84%～94%之间；在0.4 mg/kg 添加水平下，肟菌酸在质控样本中的回收率在88%～94%之间，均可满足《农作物中农药残留试验准则》的要求[23]，说明该检测方法稳定可靠，田间试验样品检测的结果可靠。

2.2 最终残留量

番茄属于茄果类蔬菜，中国制定的吡噻菌胺在茄果类蔬菜中的MRL 值为2 mg/kg，肟菌酯在番茄中的MRL 值为0.7 mg/kg[24]。由表4可知：12 个试验点中，吡噻菌胺和肟菌酯的残留量均小于中国制定的MRL 值。此外，从表中还可以看出，两种农药在采收间隔期为7 d 时的最高残留量均大于采收间隔期为5 d 时的值，这是由于贵州采收间隔期为7 d 的两份样品中有1 份样品的残留量经多次检测均较高所致。推断可能是田间试验人为因素引起的偶然偏差。

表4 吡噻菌胺、肟菌酯、吡噻菌胺 (总量) 和肟菌酯 (总量) 在12 个试验点番茄样品中的最终残留量 (n = 2)Table 4 Terminal residues of penthiopyrad, total penthiopyrad (sum of penthiopyrad and PAM), trifloxystrobin and total trifloxystrobin (sum of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid) in tomato samples from 12 test sites (n = 2)

PAM 和肟菌酸在不同采收间隔期的番茄中的残留量均小于LOQ (0.05 mg/kg) ，吡噻菌胺、肟菌酯和吡噻菌胺 (总量) 和肟菌酯 (总量) 在番茄中的残留消解动态检测结果如表5 所示。可以看出，吡噻菌胺 (总量) 的初始残留量在0.13～1.1 mg/kg，肟菌酯 (总量) 的初始残留量在0.12～0.31 mg/kg。番茄中吡噻菌胺 (总量) 和肟菌酯 (总量) 的残留量基本上随采收时间的延长而减小，除贵州试验点外，其余3 个试验点的残留量均在采收间隔期为10 d 时下降至小于LOQ。

表5 吡噻菌胺、肟菌酯、吡噻菌胺 (总量) 和肟菌酯(总量)在4 个试验点番茄样品中的残留消解动态 (n = 2)Table 5 Dissipation of penthiopyrad, total penthiopyrad (sum of penthiopyrad and PAM), trifloxystrobin and total trifloxystrobin (sum of trifloxystrobin and trifloxystrobin acid) in tomato (n = 2)

农药残留的减少主要受物理或化学因素的影响，也可能与生长稀释因子、土壤特性、基质类型以及其他人为因素引起的偶然偏差有关。Noh 等对紫苏叶上吡噻菌胺残留量的研究表明，末次施药后7 d 的吡噻菌胺残留量是0 d 残留量的44.2%[12]；Wang 等的研究表明，肟菌酯在番茄中的半衰期为2.9 ～ 5.4 d[8]，本研究所得结果与之相符。

2.3 膳食风险评估

GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定吡噻菌胺的ADI 值为0.1 mg/(kg bw)，肟菌酯的ADI 值为0.04 mg/(kg bw)。目前，吡噻菌胺在中国的登记作物有番茄、黄瓜、葡萄，肟菌酯在水稻、小麦、番茄和辣椒等10 类28 种作物上进行了登记。对于没有残留试验中值的登记作物，按风险最大化的原则取相应的MRL 值代替残留试验中值，确保风险评估的可靠性。各类登记作物的膳食量和参考限量见表6。番茄所在的深色蔬菜类作物的STMR 采用推荐的采收间隔期为5 d 的番茄样品中吡噻菌胺 (总量)和肟菌酯 (总量) 的残留试验中值0.10 mg/kg。利用公式 (4) 将NEDI 与每日允许摄入量 (ADI) 进行比较。

表6 吡噻菌胺和肟菌酯的膳食风险评估Table 6 Dietary risk assessment of penthiopyrad and trifloxystrobin

结果 (表6) 表明：普通人群吡噻菌胺的NEDI为0.1382 mg，风险商RQ 为2.2%；普通人群肟菌酯的NEDI 为0.2645 mg，风险商RQ 为10.5%，其结果均远低于100%，说明在推荐的GAP条件下施用30%吡噻菌胺•肟菌酯悬浮剂，对一般人群健康不会产生不可接受的风险。该结果与前人的研究结果一致[12,15,18]。

3 结论

本研究建立了运用QuEChES-HPLC-MS/MS同时检测番茄中吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸残留量的方法。该方法在线性度、准确度、精密度和灵敏度上都能满足(NY/T 788—2018) 《农作物中农药残留试验准则》 的要求，适用于检测番茄中吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸的残留。通过在全国12 个番茄主产区进行田间规范残留试验，在末次施药后5 和7 d 采集的番茄样品中，吡噻菌胺的残留量均低于0.26 mg/kg，吡噻菌胺和PAM 之和的残留量均低于0.31 mg/kg，肟菌酯的残留量均低于0.33 mg/kg，肟菌酯和肟菌酸之和的残留量均低于0.38 mg/kg。膳食风险评估结果显示，吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的膳食风险商分别为2.2%和10.5%，说明对一般人群健康不会产生不可接受的风险。参照以上数据，结合番茄的生长特点和消费习惯，推荐在使用30% 吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂防治番茄灰霉病时，施药剂量为有效成分270 g/hm2，于番茄灰霉病发生初期喷雾施药2 次，施药间隔7 d，安全间隔期5 d。

本研究建立的吡噻菌胺、PAM、肟菌酯和肟菌酸残留同时检测的方法，丰富了吡噻菌胺和肟菌酯在番茄中的最终残留量数据和膳食风险评估数据，为30%吡噻菌胺 • 肟菌酯悬浮剂在番茄田间的安全使用提供了理论依据和数据支持。