具备高同型半胱氨酸血症的实验性结肠炎模型的建立

丁 浩，梅 俏，刘晓昌，曹立宇，甘惠中，许建明

(安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化病重点实验室，安徽合肥 230032)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含硫氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化过程中的中间产物。Hcy可造成细胞氧化损伤，引起炎症介质释放、刺激血管平滑肌增殖、干扰脂质代谢等［1］。高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是心脑血管疾病、终末期肾病等多种疾病的危险因素［2］，降低血浆Hcy水平对心血管和肾脏疾病能起到预防和治疗作用［3］。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，是病因尚未明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病。研究表明IBD患者血浆和结肠粘膜组织中存在Hcy水平增高［4］，但此现象与IBD肠粘膜损伤的具体关系尚不十分明确。因此，本研究拟建立一种具备HHcy特征的实验性结肠炎模型，有助于探讨Hcy与结肠炎的相互关系及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂 SD大鼠，SPF级，♂，体质量200 g±20 g，购于安徽省动物中心。TNBS(031M5021)、DL-同型半胱氨酸(MW 135.18，121M39044)均购自美国Sigma公司。髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验分组 每组8只大鼠。在室温，光照周期12 h∶12 h条件下适应性饲养1周后使用。

A组:正常对照组，生理盐水灌肠1次后，每天皮下注射生理盐水，每天2次，间隔8 h，连续30 d;B组:正常对照+Hcy注射组，生理盐水灌肠1次后，每天皮下注射Hcy，0.03 μmol·kg－1，每天2 次，间隔8 h，连续30 d;C 组:TNBS 模型对照组，TNBS/乙醇混合溶液灌肠1次后，每天皮下注射生理盐水，每天2次，间隔8 h，连续30 d;D组:TNBS模型+Hcy注射组，TNBS/乙醇混合溶液灌肠1次后，每天皮下注射Hcy，0.03 μmol·kg－1，每天 2 次，间隔 8 h，连续 30 d。

1.3 模型制备和给药方法

1.3.1 结肠炎模型制备 参照文献方法［5］，造模前24 h禁食不禁水，10%水合氯醛(250 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，用橡胶管经肛门插入大鼠结肠内8 cm左右，注入以等体积乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg－1)溶液。对照组灌肠等体积生理盐水。

1.3.2 高同型半胱氨酸血症模型制备 参照文献方法［6］，DL-Hcy溶于0.9%NS，滴定pH至7.4，皮下注射Hcy(0.03 μmol·g－1)，每天2 次，间隔 8 h，连续 30 d。对照组皮下注射等体积生理盐水。

1.4 标本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采血以3 000 r·min－1离心10 min，取上清保存于－80℃。切取远端结肠约8 cm，沿纵轴剪开肠管，冰生理盐水冲洗干净，取部分结肠行HE染色及匀浆检测。

1.5 检测方法

1.5.1 大鼠血浆和结肠组织Hcy水平检测 采用HPLC-FD方法［7］检测。取血浆和结肠组织匀浆100 μl，加入丁基膦10 μl，混匀后于4℃反应30 min;加入10%三氯醋酸100 μl混匀后置于室温10 min;13 000 r·min－1离心10 min;取上清液50 μl于试管内，依次加入1.55 mol·L－1NaOH 10 μl，硼酸缓冲液 125 μl，荧光试剂 SBD-F 50 μl，混匀后置于 60℃ 水浴 60 min。取20 μl进样分析。色谱条件:18C色谱柱，柱温为室温，流动相A液为乙腈、B液为磷酸盐缓冲液.流速为0.4 m·min－1，激发波长为385 nm，发射波长为515 nm。

1.5.2 疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分 实验过程中每日观察大鼠体重变化和大便性状，并且每日观察或用粪便隐血试纸检测大便带血情况，按文献方法［8］行DAI评分。

1.5.3 大鼠结肠病理检查 取病变明显肠段，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，HE染色，显微镜下观察炎症情况，参照文献［9］行病理组织学评分(histological index，HI)。

1.5.4 结肠匀浆MPO活性检测 取结肠组织制备10%结肠组织匀浆，按说明书要求测定各样本吸光度(A)值，计算MPO活性。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆和结肠粘膜Hcy水平比较 与A组比较，B组大鼠血浆和结肠粘膜 Hcy水平明显增高(P＜0.01)。与C组比较，D组大鼠血浆和结肠粘膜Hcy水平明显增高(P＜0.01)，见Tab 1。

Tab 1 Levels of Hcy in plasma and colon mucosa after chronic administration

2.2 Hcy对TNBS结肠炎大鼠结肠损伤的影响 与A组比较，C组和D组大鼠体重明显减轻，出现不同程度的肉眼血便，DAI评分增高见Tab 2，结肠粘膜病理示结肠黏膜上皮细胞破坏，大量炎细胞浸润，黏膜下层水肿见图1，HI评分明显增高(P＜0.01)，大鼠结肠匀浆中MPO活性明显增高，见Tab 2。与C组比较，D组大鼠DAI评分和结肠粘膜病理损伤加重，HI评分和结肠匀浆MPO活性增高(P＜0.01)见Tab 1，Fig 1。

Tab 2 Effect of Hcy on DAI and HI scoring and MPO activity in the TNBS-induced colitis rats

Fig 1 Histopathologic features of the colon in association with colitis(HE×40)

3 讨论

TNBS是一种半抗原，在乙醇破坏肠黏膜屏障后，TNBS渗入结肠与大分子物质结合为完全抗原，引起结肠炎。这种结肠炎模型广泛用于炎症性肠病的研究。本实验中，采用TNBS/乙醇灌肠后，大鼠出现明显的大便性状改变和体重下降，HI评分和结肠组织MPO活性增高，表明TNBS结肠炎模型制备成功。

多项研究结果显示，IBD患者血浆和结肠黏膜组织Hcy水平明显高于对照组，可能与血浆叶酸、VitB12、VitB6水平降低以及 Hcy代谢酶基因多态性有关［7，10］。本文可见到TNBS结肠炎大鼠血浆和结肠组织Hcy水平增高，可能与腹泻引起包括维生素类等营养物质的吸收障碍有关。

Hcy可通过氧化损伤破坏细胞结构和功能;促进释放多种炎性介质(NF-κB、IL-6、IL-1β等)加重组织炎症损伤;刺激血管平滑肌细胞增殖，增加胶原生成和沉积，参与血管重塑［4］;引发内质网应激反应引起肠黏膜上皮炎症状态［11］。在有关Hcy与心脑血管疾病的研究中，采用高蛋氨酸［12］或Hcy 饮食［13］、皮下注射 Hcy［6］、胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因敲除［14］等多种方法制备HHcy模型。高蛋氨酸或Hcy饮食造成的HHcy模型与大鼠体重变化相关，因大鼠对富含蛋氨酸或Hcy饲料或饮水的摄入量不稳定［15］。选择CBS基因敲除大鼠可制备较稳定HHcy模型，但由于费用高昂未能被广泛应用。采用皮下注射Hcy造成的慢性轻度HHcy模型类似于人类心脑血管等疾病中Hcy水平，不依赖于大鼠摄食或饮水，稳定性较好［6］。通过以上方法建立的HHcy模型为研究心脑血管疾病的发病机制和药物防治起到重要作用。但由于缺乏具备HHcy特征的结肠炎模型，Hcy是否参与IBD结肠黏膜病理损伤及其机制尚未明确。因此，本研究拟通过联合TNBS/乙醇灌肠及皮下注射Hcy制备一种具备HHcy的实验性结肠炎模型。

在本研究中，通过连续30 d皮下注射Hcy，大鼠血浆和结肠粘膜组织Hcy均明显增高，表明HHcy模型制备成功。与TNBS模型对照组比较，同时采用皮下注射Hcy的结肠炎大鼠DAI和HI评分增高，结肠组织MPO活性增高，提示HHcy加重结肠炎大鼠结肠炎症损伤。具备高同型半胱氨酸血症特征的实验性结肠炎模型的成功建立，初步证实Hcy可加重结肠炎症损伤，为Hcy与结肠炎病理损伤关系及其机制的进一步研究提供实验依据。

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