1-甲基海因对抑郁大鼠行为学的影响及机制初探

游杰舒，张瑞睿，王春国，石晋丽，郭建友，史淑宁，候文慧，刘 勇

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100029;2.中国科学院心理健康重点实验室，中国科学院心理研究所，北京 100101)

抑郁症是一种常见的情感性障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，且心境低落与其处境不相称，严重者可出现自杀念头和行为。据世界卫生组织(WHO)预计，到2020年抑郁症将成为仅次于心血管病的全球第二大疾病［1］。目前一线的抗抑郁药物主要作用于单胺类神经递质，但这仅对30%的抑郁症患者起作用［2］。探究抑郁症的其他机制，寻求开发抗抑郁新药已成为近年来研究的热点。大量研究表明抑郁症患者与下丘脑－垂体－肾上腺轴(HPA轴)密切相关，还有学者提出了“抑郁障碍的神经营养假说”，认为抑郁症是由于脑内BDNF降低所引起的，抗抑郁药可增加脑中BDNF含量，提高突触的可塑性和促进神经元的生存，从而改善抑郁症状［3］。

哈蟆油(Ranae Oviductus，RO)，为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensisDavid)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得，味甘、咸，性平，归肺、肾经，具补肾益精、养阴润肺的功效，收载于2010年版《中国药典》。本课题组前期研究发现哈蟆油石油醚部位和95%乙醇部位可能具有抗抑郁作用。有文献报道称1-甲基海因是从哈蟆油95%乙醇中分离得到的单体［4］，而且研究还发现［5］烷基取代海因类化合物作为钠通道阻滞剂，可以用于治疗和预防局部或全身缺血而造成的神经功能丧失，以及退化性神经紊乱，包括运动神经元疾病、忧虑症、癫痫症等，还可用作抗心率失常药、麻醉药和抗躁狂药，因此推测哈蟆油抗抑郁作用的有效成分可能是1-甲基海因。本研究通过化学合成得到1-甲基海因，用慢性冰水游泳应激抑郁模型考察了其抗抑郁作用及相关机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD♂大鼠，初始体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(京)2007－0001。大鼠饲养于中国科学院心理研究所SPF级动物房，光照节律12 L∶12 D(7∶00～19∶00)，室温(22±2)℃，动物可以自行摄取标准饲料和清洁饮用水，实验前大鼠适应环境7 d，每天对其进行抚摸。实验经中国科学院心理研究所实验动物伦理委员会批准。

1.2 药品与试剂 ①1-甲基海因自制，并经高效液相色谱与1-甲基海因标准品(中国药品生物制品检定所，111836)进行鉴定，纯度达98%以上。临用时将1-甲基海因与生理盐水配成所需浓度的溶液。同时，空白组用生理盐水作为对照。②盐酸氟西汀(Fluoxetine，Prozac百忧解，礼来苏州制药有限公司，A333341)，用生理盐水配成所需浓度的溶液，给药容量1 ml/200 g，新鲜配制。③总蛋白提取试剂盒(普利莱基因技术有限公司)。④大鼠皮质酮ELISA检测试剂盒(R＆D，USA)。兔抗人BDNF多抗、山羊抗人β-肌动蛋白(β-actin)多抗和ECL发光底物显色试剂盒(美国Sant Cruz公司);兔抗山羊IgG-HRP:北京中杉公司。其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 DMS-2 Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所)，高速冷冻离心机(Beckman Allegra 64R)，酶标仪(美国MULTISKAN EX PRIMARY EIA V.2.3)，UV-2800 紫外分光光度计(龙尼柯上海仪器有限公司)，垂直板电泳转移装置(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组与给药 SD♂大鼠根据体重随机分为6组，每组13只。①正常组:正常饲养 +生理盐水;②模型组:接受14 d冰水游泳应激制备抑郁模型+生理盐水;③阳性对照组:抑郁模型 +盐酸氟西汀(10 mg·kg－1·d－1);④ 1-甲基海因低剂量组:抑郁模型 +1-甲基海因低剂量(20 mg·kg－1·d－1);⑤1-甲基海因中剂量组:抑郁模型+1-甲基海因中剂量(40 mg·kg－1·d－1);⑥ 1-甲基海因高剂量组:抑郁模型+1-甲基海因高剂量(80 mg·kg－1·d－1)。药物配制浓度分别为4、8 和16 g·L－1，给药量1 ml/200 g，每天1 次，连续14 d，在 d 14 1-甲基海因各剂量组和盐水对照组末次给药1 h后，盐酸氟西汀组给药0.5 h后，于8∶00～14∶00进行行为学测试。

2.2 慢性冰水游泳应激大鼠模型 按照文献方法［6］建立抑郁症大鼠模型。除正常组外，其余各组每天8∶00～10∶00在2.0 ml×1.0 mW ×1.5 mH的水池中冰水游泳5 min，连续14 d。

2.3 体重检测 分别于实验第1、7和14天称取大鼠体重。

2.4 蔗糖水消耗实验 实验前1 d禁水禁食22 h，于第1和14天分别测试2 h内糖水消耗量以及水消耗量，计算糖水偏爱度(糖水偏爱度/%=糖水消耗量/总液体消耗量×100%)。

2.5 旷场实验(open-field test) 用Morris水迷宫系统(由圆形水池、图像自动采集和处理系统组成)进行大鼠旷场实验。圆形水池为100 cm×100 cm×50 cm，四周底面全部涂黑的无盖圆筒。实验前让大鼠自由探究5 min。正式实验时，将大鼠放入旷场的边缘区，采用视频跟踪分析系统自动记录大鼠5 min的活动情况。观察大鼠的运动距离和进入旷场中央(半径33 cm的圆形区域)的时间百分比。

2.6 血清皮质酮浓度的测定 行为学实验结束后，立即断头取血，4 ℃ 3 000 r·min－1离心 15 min，取上清液于－20℃保存待测。用ELISA法检测血清中皮质酮含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，最后酶标仪上于450 nm波长测定吸光度(OD)值，以μg·L－1表示其含量。

2.7 蛋白免疫印迹分析 行为学实验结束后，立即断头，在冰上取海马组织，置－80℃保存备用。大鼠海马组织总蛋白提取按总蛋白提取试剂盒(普利莱基因技术有限公司)说明书操作，并用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白浓度。取总蛋白(50 μg)在SDS-PAGE凝胶上电泳分离2 h，将凝胶湿转至PVDF膜。取出PVDF膜，浸于封闭液中室温轻摇封闭1 h，用TBST缓冲液漂洗干净，浸入TBST稀释的一抗(兔抗人BDNF抗体1∶2 000;山羊抗人β-actin抗体1∶2 000)，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗1次，10 min。同上方法准备二抗(兔抗山羊IgGHRP 1∶500)稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min;再用TBS洗1次，10 min。之后用ECL检测试剂盒显色，曝光、显影和定影，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2.8 统计学分析 用SPSS 16.0软件对数据进行统计，结果以±s表示。实验结果两组比较采用双侧t检验，多组间比较先用单因素方差分析，差异有显著性时再用Dunnett’t检验进行统计分析。

3 结果

3.1 1 -甲基海因对抑郁模型大鼠体重的影响 结果表明，各组在第1天和第7天大鼠体重均无差异(P＞0.05)。在第14天时，和空白组比较，模型组体重明显下降(P＜0.01);和模型组比较，阳性药组和1-甲基海因20，40 mg·kg－1剂量组均能明显增加抑郁大鼠的体重(P＜0.05)。见Fig 1。

3.2 1 -甲基海因对抑郁模型大鼠蔗糖偏好的影响结果表明，各组在第1天蔗糖偏爱度无差异(P＞0.05)。在第14天时，和空白组比较，模型组大鼠蔗糖偏爱度明显下降(P＜0.05);和模型组比较，阳性组和1-甲基海因各剂量组均能明显增加抑郁大鼠的蔗糖偏爱度(P＜0.05)。见Fig 2。

Fig 1 Effect of 1-methylhydantoin on body weight in rats(±s，n=13)

Fig 2 Effect of 1-methylhydantoin on sucrose preference in rats( ± s，n=13)

3.3 1 -甲基海因对抑郁模型大鼠旷场实验的影响结果表明，在第14天时，和空白组比较，模型组大鼠的运动距离明显下降(P＜0.01)，阳性药组和1-甲基海因20，40 mg·kg－1剂量组能明显增加抑郁大鼠的运动距离(P＜0.05)。和空白组比较，模型组大鼠进入中央区时间百分比明显下降(P＜0.05)，阳性药组和1-甲基海因各剂量组有增加大鼠进入中央区时间百分比的趋势，但结果不明显(P＞0.05)。见 Tab 1。

3.4 1 -甲基海因对抑郁模型大鼠血清皮质酮的影响 结果表明，与空白组相比，模型组大鼠血清中皮质酮的含量增加(P＜0.01);和模型组相比，阳性药组和1-甲基海因各剂量组均能降低皮质酮的水平(P＜0.05)。见 Fig 3。

Tab 1 Effect of 1-methylhydantoin on the open-field test in rats(±s，n=13)

Tab 1 Effect of 1-methylhydantoin on the open-field test in rats(±s，n=13)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs chronic forced swim stress group

Group Dose/mg·kg－1 Total distance/cm Percentage of time spent in central area/%_____Control / 4117.03 ±128.22 6.07 ±1.53 Stress / 3483.29±229.61＊＊ 2.34±0.57＊＊Fluoxetine 10 4018.85 ±129.94# 2.70 ±0.54 1-methylhydantoin 20 3964.49 ±139.78# 3.00 ±0.55 40 4087.08 ±89.57# 3.47 ±0.66________________80___________3766_____________________________.45__±216.74__3.51__±0.35

Fig 3 Effect of 1-methylhydantoin on the corticosterone levels in rats(±s，n=13)

3.5 1 -甲基海因对抑郁模型大鼠海马BDNF蛋白表达的影响 结果表明，与空白组相比，模型组大鼠海马BDNF蛋白表达降低(P＜0.01);和模型组相比，1-甲基海因20和40 mg·kg－1剂量组均能增加BDNF蛋白的表达 (P＜0.01)。见Fig 4。

4 讨论

慢性冰水游泳应激是我们实验室常用的抑郁模型之一。前期实验已经证实［6－8］该模型能够引起动物的体重下降，旷场实验中活动减少，蔗糖偏爱度减少，这些与人的抑郁状态(如体重减少、对事物失去兴趣、绝望、快感缺失等)相似。因此，本实验采用慢性冰水游泳应激建立大鼠抑郁模型，观察1-甲基海因对大鼠抑郁行为的影响及其作用机制。实验结果表明，慢性冰水游泳应激可致大鼠产生抑郁行为，1-甲基海因40 mg·kg－1能明显改善大鼠的体重下降，增加糖水偏爱度以及增加大鼠在旷场中的运动距离，这说明1-甲基海因具有明确的抗抑郁作用，且在40 mg·kg－1的剂量下抗抑郁效果最佳，并且与其降低皮质酮水平及增加BDNF的表达程度相一致。1-甲基海因对慢性冰水游泳应激大鼠的抗抑郁作用不具有典型的剂量依赖性，我们前期进行的蛤蟆油提取物抗抑郁药理实验中也出现了类似的现象［9］。这可能是因为高剂量1-甲基海因或代谢产物具有肝药酶诱导剂的作用，加快药物分解代谢，使其失去药理活性所致［10］。

Fig 4 Effect of 1-methylhydantoin on BDNF levels in hippocampus of rats(±s，n=13)

下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴系统是神经内分泌系统的一个重要分支，在应激状态时促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌增多，进而影响促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌，后者又能引起皮质酮(CORT)分泌增加，使HPA轴过度活化［11］。临床研究也表明，抑郁症患者的HPA轴功能失调，血清中皮质醇(人体内为皮质醇，动物为皮质酮)水平升高，皮质醇水平可反映抑郁症的严重程度［12］。作者研究发现，慢性冰水游泳应激性引起的HPA轴亢进，表现为血清皮质酮水平增加，而1-甲基海因能明显降低大鼠血清皮质酮的含量，提示1-甲基海因的抗抑郁作用可能是通过调节HPA轴功能来实现的。

BDNF与HPA轴存在着广泛的相互作用，海马是他们之间最主要的相互作用部位。应激引起海马神经元损伤可能是中枢许多应激反应的关节点，保护中枢神经元，尤其是海马神经元免受伤害，是防治应激相关疾病的重要措施之一［13］。抑郁症病人海马结构受损，体积较正常人减小，这可能是由于高皮质醇导致兴奋性氨基酸堆积，从而引起海马神经元萎缩、丢失、死亡。而BDNF作为最早发现的一种神经营养因子，它可以调节神经元和突触的可塑性，对中枢神经元的增殖和修复有重要的意义［14］。本实验结果也表明，慢性冰水游泳应激抑郁大鼠海马区BDNF的水平明显降低，1-甲基海因治疗后能上调慢性应激抑郁引起的大鼠BDNF水平下降。

HPA轴的异常和基础是CRF分泌过多，导致ACTH分泌也异常增高。没有检测皮质和海马中的CRF、ACTH含量，这是本次实验的主要不足之处。但慢性应激性引起的HPA轴亢进、CRF和ACTH分泌增高主要影响肾上腺，导致肾上腺皮质CORT分泌增加。因此，CORT水平可以直接反映HPA轴的兴奋性。本实验研究发现，抑郁模型大鼠，血清中CORT水平升高，提示HPA兴奋性异常升高，这也与其他的研究相一致［15］。目前测定抑郁症模型大鼠皮质和海马皮质酮含量的研究较少，这可能由于HPA轴兴奋后导致肾上腺分泌的皮质酮主要进入血液，导致血液中皮质酮含量升高，因此本文中我们也只检测了血液中的皮质酮水平。

综上所述，1-甲基海因对慢性冰水游泳抑郁大鼠具有抗抑郁作用，其作用机制可能与HPA轴功能状态以及BDNF密切相关。1-甲基海因对HPA轴功能的调节作用还有待于进一步的研究。

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