苦参碱改构体X调控Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9蛋白表达诱导人鼻咽癌CNE1凋亡的研究

陈 俊，唐安洲，梁 钢，王立升，谢 貌，张 俊

(1.广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，广西南宁 530021;2.广西中医药大学药学院，广西南宁 530001;3.广西医科大学药学院，广西南宁 530021;4.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004)

苦参碱(Matrine)是一类具有多方面药理活性的生物碱。近年来，发现该药物在抑制肿瘤生长、杀伤和诱导肿瘤细胞凋亡等研究中表现出明显活性［1－4］。有报道表明苦参碱对鼻咽癌也有一定的抑制作用［5－7］，能够引起人鼻咽癌 CNE2细胞的增殖抑制和凋亡增加，并对Caspase途径有激活作用［7］。本实验室前期研究发现由苦参碱改构合成的苦参碱改构体X(14-噻吩基次亚甲基苦参碱，Fig 1)具有强于苦参碱体外抑制鼻咽癌细胞增殖的作用，且对人脐静脉内皮细胞无损伤［8］，这种特性使得改构体X有望成为一种新型的抗鼻咽癌药物。本研究旨在前期研究工作基础上，将改构体X体外作用于人鼻咽癌细胞CNE1，观察其对CNE1细胞超微结构的影响，并对Caspase蛋白家族中具有代表性的凋亡相关蛋白表达进行检测，以探讨其抗鼻咽癌的作用机制，为开发抗鼻咽癌的治疗药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人鼻咽癌细胞株CNE1于中南大学湘雅中心实验室所购得，本实验室接种保存。培养条件为:含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5%CO2饱和湿度培养。

1.2 药物与试剂 苦参碱和苦参碱改构体X由广西大学王立升教授提供和协助合成，单体纯度＞98%;药物用DMEM培养液稀释，过滤除菌，4℃保存。顺铂(DDP)注射液，南京制药厂有限公司;DMEM培养液、胎牛血清，Hyclone公司;胰蛋白酶，GIBCO公司;PBS，Sigma公司;细胞裂解液，上海碧云天公司;一抗抗兔Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和HRP标记山羊抗兔IgG，Proteintech group公司;内参GAPDH，上海康成生物有限公司。

1.3 仪器 CKX41倒置显微镜(Olympus)，－80℃超低温冰箱(Forma)，58108高速冷冻离心机(Eppendorff)，2300型 CO2培养箱(Shellab)，H-7650型透射电镜(日立)。

1.4 细胞培养与给药 将CNE1细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素和1×105U·L－1链霉素的DMEM细胞培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱内培养，定期观察，用2.5 g·L－1胰蛋白酶联合0.02%EDTA消化传代。

将对数生长期的CNE1接种于6孔培养板中，接种密度为每孔3×105个，生长至80%以上融合度时，分别加入低、中、高剂量(29、58、116 μmol·L－1)的苦参碱改构体X，另设空白DEME培养细胞作为阴性对照组、DDP 组(6.67 μmol·L－1)及苦参碱组(7 258 μmol·L－1，为实验测试出的苦参碱对 CNE1 48 h的IC50)。处理时间为48 h。

1.5 细胞超微结构观察 分别收集作用CNE1细胞48 h后的苦参碱改构体X各剂量组、DDP组、苦参碱组与阴性组各1 ml，PBS洗3次，预冷的2%戊二醛4℃固定2 h以上，1%锇酸后固定1.5 h后，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，作0.5 μm切片，醋酸双氧铀及枸椽酸铅染色，透射电镜观察照相。

1.6 Western blot检测 Caspase-3，Caspase-8 和Caspase-9蛋白的表达 分别收集作用CNE1细胞48 h后的苦参碱改构体X各剂量组、DDP组、苦参碱组与阴性组，0.01 mol·L－1预冷 PBS洗细胞3次，加入含有5 μl PSMF 的 RIPA 缓冲液500 μl冰上裂解细胞30 min;然后4℃、12 000×g离心15 min;取上清，BCA试剂盒进行蛋白定量测定蛋白浓度，后与SDS-PAGE蛋白缓冲液按照比例混合，煮沸5 min，立即分装，置 －20℃备用。取15 μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜至PVDF膜，分别检测Caspase-3，-8和-9的表达水平，GAPDH作为内参。对目的条带灰度值进行半定量分析，取目的条带与内参条带灰度值比值为相对表达量。

1.2.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行方差分析，LSD检验两组间差异。

2 结果

2.1 透射电镜观察药物对CNE1细胞超微结构的影响 透射电镜下，阴性对照组细胞具有癌细胞的一般特征，细胞核大，核仁清晰，核边界明显，细胞核稍有内陷，常染色质多，异染色质少，细胞核与细胞质比值大，细胞内无退变的细胞器，细胞质基质密度均匀(Fig 2，F);苦参碱改构体 X各剂量组作用CNE1 48 h后，细胞呈凋亡的形态，细胞皱缩，核内异染色质明显增多，核周隙增大，细胞质内充满大小不等空泡，凋亡小体形成，线粒体空泡变性，有电子致密颗粒沉积，细胞表面微绒毛变粗变短，数量减少甚至消失，细胞膜基本完整，高剂量较中低剂量凋亡程度更加明显(Fig 2，A、B、C);苦参碱组细胞核固缩，染色质边集，电子密度增加，部分线粒体增生，水肿，嵴模糊不清，出现大量自噬体，未见明显凋亡小体(Fig 2，D);DDP组细胞大片坏死，部分凋亡指征，细胞结构溶解 (Fig 2，E)。

2.2 Western blot检测 Caspase-3，-8和-9蛋白表达的结果 苦参碱改构体X作用CNE1细胞48 h后，各剂量组细胞内Caspase-3，-8，-9的含量均有不同程度升高，具一定的剂量依赖性;Fig 3显示，与对照组相比，改构体X不同剂量组及DDP组处理后的Caspase-3明显增加，苦参碱组的Caspase-3明显增加;对于Caspase-8，低剂量改构体X与对照组差异无显著性，其他处理组均与对照组差异有显著性(Fig 4);高剂量改构体X组的Caspase-9表达增加量最高，各处理组均与对照组差异有显著性(Fig 5)。Fig 6显示 Caspase-3、Caspase-8与 Caspase-9 3种蛋白在不同处理下的表达差异。

Fig 4 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-8(±s，n=3)

3 讨论

Fig 5 Effect of derivant X of the matrine on the expression of Caspase-9(±s，n=3)

Fig 6 Expression of Caspase-3，Caspase-8 and Caspase-9 induced by derivant X of the matrine

本课题组前期研究工作中已发现，苦参碱经化学改构后的化合物(苦参碱改构体X)对人鼻咽癌CNE2细胞增殖有体外抑制作用，其48h的IC50值为(106.378 ±0.825)mg·L－1，低于苦参碱对CNE2 细胞的 IC50值 710 mg·L－1［8］;课题组通过MTT实验法检测出苦参碱和苦参碱改构体X对人鼻咽癌细胞CNE1细胞48 h的IC50分别为7 258、126 μmol·L－1(结果另文发表)，可见改构体 X 能抑制两种人鼻咽癌细胞的生长，且作用强于其先导化合物苦参碱。

本研究设置不同剂量组改构体X处理CNE1细胞，通过透射电镜观察细胞超微结构发现，苦参碱改构X处理组的肿瘤细胞皱缩，核内异染色质明显增多，核周隙增大，细胞质内充满大小不等空泡，同时可找到类圆形的凋亡小体形成，其改变有别于坏死，苦参碱7 258 μmol·L－1剂量下电镜下也出现凋亡现象，但未见明显凋亡小体，提示改构体X在低于其先导化合物苦参碱的60多倍的剂量下即可诱导细胞凋亡，其诱导凋亡的作用可能是体外抑制CNE1增殖的机制之一。

Caspase-8是作为外源性凋亡途径中的上游蛋白，可剪切激活下游凋亡执行蛋白包括Caspase-3、-6、-7［9－10］，继而导致细胞走向凋亡。研究发现，改构体X高剂量组与苦参碱组作用48h后Caspase-8的表达量相当(Fig 4);与对照组相比，苦参碱组、苦参碱改构体X中、高剂量组Caspase-8的表达明显上调，差异具有显著性;结果提示，苦参碱和改构体X均可激活细胞凋亡的外部途径的上游蛋白Caspase-8，有可能通过外部途径的激活起到诱导CNE1细胞凋亡的作用。胞质蛋白凋亡活化因子-l(Apaf-l)可通过Caspase补充结构域与Caspase-9前体的原结构域结合，导致Caspase-9自身剪切活化，活化的Caspase-9进一步激活其下游Caspase-3、-6、-7，诱导细胞从内部途径走向凋亡［11－12］。本实验对Caspase-9表达检测中发现，苦参碱改构体X低、中、高剂量组与苦参碱组可使CNE1细胞内Caspase-9表达明显升高(P＜0.01);提示改构体X对细胞凋亡的内部途径也有激活作用，与苦参碱表现出类似作用。Caspase-3是内外两条凋亡途径的共同执行蛋白，许多凋亡因子最终都是作用于下游效应器Caspase-3起到促进细胞凋亡作用［13］。试验结果显示，苦参碱改构体X低、中、高剂量组作用后可使CNE1细胞内Caspase-3表达明显升高(P＜0.01)，提示改构体X可能是通过激活凋亡的内外途径中的上游蛋白Caspase-8、9，从而起到激活下游的凋亡执行蛋白Caspase-3而产生促进细胞凋亡的作用。改构体X保留了先导化合物上调促凋亡蛋白表达的作用机制，而且上调表达能力更强，增多了诱导人鼻咽癌细胞凋亡途径，对于是否可通过其他凋亡机制参与诱导调亡有待进一步研究。

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