早发冠心病患者结合珠蛋白的基因多态性

曲 艳 王云英 刘 格 纪莉莎 张七一 (青岛大学医学院附属青岛市立医院，山东 青岛 266011)

结合珠蛋白(Hp)又称触珠蛋白，是一种酸性糖蛋白，主要由肝脏合成，广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中，Hp与C-反应蛋白(CRP)同属急性期反应蛋白。目前已有大量的临床研究显示，CRP水平与冠心病的发生发展有关，可作为急性冠脉综合征判断预后的独立因素〔1〕，而Hp是否有助于冠心病的诊断，其基因多态性与冠心病易感性及冠状动脉病变严重程度是否存在相关性，尚未见到相关文献的报道。本研究的主要目的是分析早发冠心病患者结合珠蛋白基因型频率的分布，并探讨其易感性及其与冠状动脉病变严重程度是否存在相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2010年5月至2011年1月在青岛市市立医院西院心内科住院病人中经过冠脉造影确诊的冠心病患者92例，年龄男性≤55岁，女性≤65岁(平均52.40岁)。另外选取市立医院东院区体检中心通过各项临床检查完全排除冠心病的74例健康查体者作为对照组，年龄男性≤55岁，女性≤65岁(平均51.27岁)。排除标准:所有对象均做血常规、血生化、12导联心电图、X线胸片、心脏彩超，临床上需除外既往经皮腔内冠状动脉成形术或冠状动脉搭桥术、心衰病史、心脏瓣膜病、严重心律失常、结缔组织病、急性感染、恶性肿瘤、肝肾功能不全、严重创伤或重大手术。

1.2 研究分组 所有患者均采用Judkins法行选择性冠状动脉造影多体位投照。冠心病的诊断根据临床表现结合冠脉造影结果，至少一支冠脉血管狭窄大于50%即确诊冠心病。采用Gensini冠状动脉评分系统〔2〕(Gensini积分)对冠状动脉的狭窄程度进行分组，根据积分将早发冠心病患者分为:A组积分＜50分，B组50分≤积分＜90分，C组积分≥90分三个亚组。Gensini积分〔2〕根据受试者的冠脉造影结果，将冠脉分成14段，根据病变血管不同节段制定不同的权重系数，再根据冠脉管腔狭窄程度给以不同的权重系数，将狭窄程度权重系数乘以各病变血管的权重系数，最后总积分为各分支血管积分之和。狭窄程度以最严重处为标准:狭窄直径≤25%计1分，狭窄直径25% ～50%计2分，狭窄直径51% ～75%计4分，狭窄直径76% ～90%计8分，狭窄直径91% ～99%计16分，狭窄直径100%计32分。病变血管不同节段权重系数:左主干×5，前降支近段×2.5，前降支中段 ×1.5，前降支远段 ×1，回旋支近段×2.5(开口处×3.5)，回旋支远段、钝缘支、右冠状动脉、后降支及第1对角支均×1，第2对角支及后侧支×0.5。

1.3 Hp基因型的检测 采集受试者的静脉血2 ml，EDTA抗凝，置于离心机内以1 800 r/min离心10 min，分离出血浆。用天根公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒提取受试者血液DNA。参考Koch等〔3〕对Hp基因分型的PCR实验方法进行分型检测。分别用引物A和B扩增Hp1特异性的1 757 bp片段和Hp2特异性的3 481 bp片段，用引物C和D扩增Hp2特异性的349 bp片段进一步验证。上游引物A:5'-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3'，下游引物 B:5'-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3'，扩增Hp1特异性的1 757 bp片段和Hp2特异性的3 481 bp片段。PCR反应体系包括模板 DNA 5 μl，10×Tap缓冲液(用 MgCl2)2.5 μl，2.5 mm dNTP 混合物 2 μl，10 μm 上下游引物各 0.5 μl，Tap plus DNA 聚合酶(2.5 U/μl)0.5 μl，加入ddH2O补至25 μl体系。上游引物C:5'-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3'，下游引物 D:5'-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3'，扩增Hp2的349 bp特异性片段，反应体系与上相同。扩增条件:在PCR热循环仪上扩增，95℃预变性2 min，95℃变性1 min，69℃退火和延伸2 min(A和 B扩增时)或1 min(C和D扩增时)，共35个循环后72℃终末延伸7 min。PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳，经125 V 30 min，在紫外光下观察，摄影。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件分析。冠心病组和对照组Hp基因型频率分布采用χ2检验，冠心病亚组间及不同基因型Gensini积分采用非参数Kruskal-Wallis检验。

2 结果

2.1 HP基因型分型 见图1所示:条带1、3、5为引物A、B扩增产物，其中750 bp经测序为B引物单独扩增序列，不影响结合珠蛋白基因分型，条带1、3含1 757 bp为Hp1等位基因扩增产物;条带2、4、6为引物 C、D 扩增产物，条带4、6含 349 bp为Hp2等位基因扩增产物。Hp1-1基因型显示条带1、2;Hp1-2基因型显示条带3、4;Hp2-2基因型显示条带5、6。

2.2 早发冠心病组与对照组患者一般临床资料比较 性别、年龄、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均无统计学差异(P＞0.05)，见表1。早发冠心病三个亚组间的性别、年龄无统计学差异(P＞0.05)，但C组TC及LDL含量较A、B两组高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.3 各组Hp2-2基因型频率 早发冠心病组与对照组间的Hp2-2基因型出现频率分别为43.48%、54.05%，两组间Hp基因型分布无统计学差异(χ2=1.958，P=0.376)。早发冠心病组亚组间的 Hp2-2基因型出现频率分别为28%、50%、77.78%，差异有统计学意义(χ2=17.953，P ＜0.001)，C 组Hp2-2基因频率明显高于A组。且 Hp2-2基因型积分(65.52±40.580)明显高于Hp1-1基因型(22.50±13.844)和Hp1-2基因型(47.05±25.504)，差异有统计学意义(F=16.214，P ＜0.001)。

图1 结合珠蛋白基因型电泳结果

表1 早发冠心病组与对照组一般临床资料比较(s)

表1 早发冠心病组与对照组一般临床资料比较(s)

指标 对照组(n=74)早发冠心病组(n=92)P值

表2 早发冠心病组亚组间一般临床资料比较(s)

表2 早发冠心病组亚组间一般临床资料比较(s)

指标A组B组C组P(n=50)(n=24)(n=18)值性别(男性百分比)88.00% 75.00% 66.67% 0.109年龄(岁)51.92±3.238 53.42±3.658 52.39±4.118 0.239 TC(mmol/L)4.628±0.771 4.800±1.004 5.618±1.007 0.000 LDL(mmol/L)2.606±0.636 2.721±0.690 3.340±0.521 0.000

3 讨论

CHD是一个严重危害人类健康的复杂多因素参与的疾病，早发冠心病是CHD的特殊形式，其定义为〔4〕:冠心病发生时男性＜55岁，女性＜65岁。目前国内外研究表明早发冠心病有增多的趋势，如何早期预防及诊治已引起广泛关注。冠状动脉粥样硬化是冠心病发生的基本病变，而氧化应激和炎症反应在动脉的粥样硬化过程中扮有重要作用。Hp是一种急性期反应蛋白，其主要功能是通过与游离血红蛋白(Hb)结合形成Hp-Hb复合物，并很快被单核-巨噬细胞系统介导的清道夫受体CD163清除掉，防止Hb对组织的氧化损伤，阻止Hb从肾小球滤过，避免Hb对肾小管的损害。还具有抗氧化、抗炎、抗菌、促进血管生成等作用〔5〕，而Hp的这些生理功能均与防止冠心病的发生发展密切相关。

Hp的分子结构类似免疫球蛋白，即由两条重链(β链)和两条轻链(α链)组成四聚体，而Hp的多态性主要是α链的遗传变异造成。α链有α1和α2两种，分别由83个氨基酸和143个氨基酸组成。Hpα1和α2肽链是由一对等位基因Hp1和Hp2所决定，基因定位于16q22.1，呈共显性遗传，Hp2等位基因不同于Hp1，它包含1.7 kb而Hp1没有的重复序列〔6〕，α2多肽链是由α1链的前71个氨基酸残基和后72个氨基酸残基组成的，β链含有245个氨基酸残基，分子量大约为45 000 kD〔7〕。根据α链的不同，HP有三种基本基因型:Hp1-1型为Hp1/Hp1;Hp2-1型为Hp2/Hp1;Hp2-2型为 Hp2/Hp2〔8〕。有研究表明不同基因型Hp其结构不同，功能上亦存在差异。Hp1-1型在生物学功能上结合游离血红蛋白的功能是最强的，Hp2-1型次之，而 Hp2-2 型最弱〔9〕。

本研究中早发冠心病组与对照组间Hp基因型分布无统计学差异，提示Hp基因型差异与冠心病的易感性无关，这与国外的研究结果一致〔10〕。本研究说明Hp2基因可能与冠状动脉粥样硬化狭窄程度有关，即在冠状动脉疾病中，Hp2-2型病人可患有较严重的心肌梗死及并发症。原因可能是Hp型别不同，抗氧化剂活性不同，Hp1-1型蛋白与其他型别相比具有更强的抗氧化活性〔11〕，因此Hp1-1型患者更少患冠状动脉疾病，或者有更发达的侧支循环〔12〕。有研究表明，Hp1-1的抗氧化活性强于Hp2-2，并不是因为Hp1-1与Hb的结合能力更强，而是因为Hp1-Hb复合物稳定血红素中铁离子的能力更强，而Hp2-Hb复合物仍具有较强的氧化还原活性铁〔8〕。其次，Hp2-Hb复合物经清道夫受体CD163被清除的能力最弱〔13〕，导致了体内的高的氧化应激状态，使氧化修饰的低密度脂蛋白增加而对动脉内膜造成损伤导致冠心病的发展。本研究中由于样本量较少，早发冠心病组92例，按照冠脉狭窄程度分组的病例数就更少，这可能导致统计结果的误区。下一步应行大样本量的前瞻性研究，以明确Hp2和冠状动脉病变严重程度的相关关系，为早发冠心病的预防和治疗提供新的靶点。

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