IL-1β通过NF-κB促进大鼠内侧颞叶癫痫慢性进展

甘 娜， 孔惠敏， 马玉平， 彭 镜， 吴丽文， 尹 飞

内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是指源于海马、杏仁核、海马旁回的局部癫痫性发作，是最常见的难治性癫痫之一，早期有效的治疗对预后的改善十分重要。神经元丢失、轴突出芽和突触重建是MTLE慢性期的主要病理改变，也是导致MTLE慢性发作及难治的病理基础，但其形成的机制至今仍未完全阐明。

近年来越来越多的研究显示，炎症反应及炎症因子参与了癫痫的发生发展过程，如在癫痫患者手术切除的海马组织中，星形胶质细胞活化、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及其受体表达增高，炎症细胞浸润增多［1，2］。而白介素作为最早被发现的炎症因子，在风湿、免疫、创伤等领域均有了广泛和深入研究，但目前关于IL-1β与MTLE的发生发展的关系研究甚少。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是急性炎症转录因子及神经元兴奋性和胶质瘢痕形成的参与因子，有研究显示［3］海马硬化患者海马中NF-κB表达显著增加，而MTLE病理进展中NF-κB的高表达是否与IL-1β相关少见报道。本文就IL-1β与NF-κB在MTLE的作用及相互关系开展初步观察研究，以期为MTLE的早期诊断治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型制备及分组 21日龄SD大鼠腹腔注射氯化锂(127mg/kg，美国Sigma)并随机分生理盐水对照组(对照组)、匹罗卡品诱导模型组(模型Ⅰ组)、匹罗卡品诱导及IL-1β干预组(模型Ⅱ组)。模型Ⅰ组和模型Ⅱ组于注射氯化锂17～18h后腹腔注射匹罗卡品(50mg/kg，美国Sigma)诱导出现癫痫持续状态(status epilepticus，SE)。模型Ⅱ组在 SE诱发成功0.5h后侧脑室注射 IL-1β 10ng/kg;对照组予等量生理盐水代替匹罗卡品腹腔注射。匹罗卡品诱发癫痫时，达到Lado幼鼠癫痫发作分级标准5～7级并持续2h或濒危时腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)终止发作。于8w(慢性期)后取鼠脑行后续试验。

1.2 行为学观察 急性期诱导SE发作后每天逐只观察存活鼠有无反复自发痫性发作(spontaneous recurrent seizures，SRS)以及 SRS 发作频率、强度及持续时间，直至致痫后第8周大鼠SRS基本稳定为止，出现SRS即为慢性癫痫幼鼠模型制作成功，模型组中未出现SRS者从模型组剔除。

1.3 脑电图检测 模型鼠进入慢性期后，麻醉并进行电极包埋，术后单笼饲养1w，随后进行脑电监测。每日记录脑电12h，连续1w。电极包埋坐标为:正中线左2mm，前囟后3.5mm，深2.5mm。

1.4 尼氏染色 选取经海马DG区、CA1区、CA3区的冠状切片，浸入0.1%焦油紫染液中染色10min，分色(镜下掌握时间)，流水冲洗后，梯度酒精脱水，二甲苯透明两次，各10min;中性树胶封片。镜下观察海马DG区、CA1区、CA3区神经元丢失程度。计数各组海马各区神经元数目情况。

1.5 Timm染色 选经海马DG区、CA3区的冠状切片，经梯度酒精脱水后，浸入新鲜配制的Timm孵育液。Timm孵育液配方:(1)50%阿拉伯树胶60ml;(2)柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸钠2.35g加柠檬酸2.55g溶于10ml蒸馏水);(3)对苯二酚溶液(1.7g对苯二酚溶于30ml蒸馏水);(4)17%硝酸银溶液1.5ml。暗室内新鲜配制。常温下孵育60～90min，倾去孵育液，取出载玻片，流水冲冼 5～10min终止反应，常规脱水、透明，中性树胶封片。光镜下齿状回颗粒细胞及CA3区锥体细胞层苔藓纤维终末因富含Zn2+，能被Timm硫化银染色方法特异性染色，显示为棕黄或黑色颗粒。根据MFS评分标准进行评分。

1.6 EMSA检测NF-κB蛋白在海马中的表达

取各组实验鼠新鲜海马组织提取核蛋白，以3μg蛋白量上样，分别加入5×EMSA/Gel-shift结合缓冲液 2μl、生物素标记的 NF-κB 探针1μl，用去 DNA 酶水定容至10μl，室温静置20min后，加入10×EMSA/Gel-shift上样缓冲液1μl，混匀后立即上样。用0.5 ×TBE 液，150V，电泳 60min。0.5 ×TBE 液，100V，正电荷尼龙膜转膜60min。再于紫外灯下10cm处交联10min，然后将膜封闭、洗涤、平衡后，ECL发光显影。

1.7 免疫组化检测NF-κB p65蛋白在海马中的分布与表达 取5μm厚的完整海马石蜡切片，经常规脱蜡水化，3%H2O2作用10min，微波热修复，加入一抗(NF-κB p65，1:500;购于 Abcam 公司)4℃孵育过夜。取出后0.1mol/L PBS清洗3次，每次5min，然后参照二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉PV-9000)说明书操作，加入聚合物辅助剂(试剂1)37℃作用30min。0.1mol/L PBS洗5min×3次后，与辣根酶标记山羊抗兔/小鼠IgG多聚体(试剂2)37℃作用30min，PBS浸洗5min×3次。DAB染色10min，流水充分冲洗，苏木素染核。常规脱水透明封片。于显微镜下计数阳性细胞率。

1.8 统计学处理 数据资料以均数±标准差(χ±s)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用t检验，组间两两比较采用q检验。用SPSS13.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察 模型Ⅰ组达SE并存活的模型大鼠共25只，模型Ⅱ组32只，在急性期模型Ⅰ组和模型Ⅱ组大鼠均有进食进水减少、体重增长减缓、激惹、攻击性增强等表现，并间歇出现惊厥发作，持续数秒至1min不等，但模型Ⅱ组较模型Ⅰ组更加明显。模型Ⅰ组大鼠上述症状于致痫后3～5d逐渐消失;而模型Ⅱ组持续到致痫后5～7d。致痫后第3周左右陆续有模型大鼠开始出现自发痫性发作，表现为机械性点头、咀嚼、前肢阵挛、直立等，可出现全身强直阵挛等大发作，但发作时间不长，每次发作持续约数10s～2min不等，可自行终止，发作频繁者1d发作数次，声光刺激有时可诱发发作。至致痫后第8周自发发作基本稳定，此时模型Ⅰ组和模型Ⅱ组致SE并存活模型大鼠分别为21只和22只，其中分别有13只和16只出现自发痫性发作，即急性期匹罗卡品诱导SE后存活并发展成为成年期慢性颞叶癫痫的比例为62.9%和72.7%，死亡率为19.4%和31.2%。生理盐水对照组及急性期未达SE的模型组大鼠均未见自发痫性发作(见表1)。

2.2 EEG监测模型鼠海马异常放电 对照组呈现波幅、节律基本正常的EEG;模型Ⅰ组和模型Ⅱ组均记录到脑电图出现典型尖棘波、棘慢波发放，波幅明显增高。

2.3 尼氏染色观察海马区神经元丢失 模型Ⅰ组和模型Ⅱ组各区均见大量神经元脱失，出现空泡样变性，核固缩;细胞形态不完整、细胞排列松散、紊乱，有较多间隙。于高倍镜下计数神经元个数，模型Ⅰ组和模型Ⅱ组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05);模型Ⅰ组与模型Ⅱ组比较有显著性差异(P＜0.05)。各组海马各区神经元数目情况(见表2)。

2.4 Timm染色观察神经元苔藓样出芽 对照组大鼠DG区及CA3区苔藓纤维层有密集浓染的黑色颗粒，偶尔或极少见到有苔藓纤维穿越齿状回颗粒细胞层到达内分子层;模型Ⅰ组和模型Ⅱ组可见较多连续分布的Timm颗粒，与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)。模型Ⅰ组和模型Ⅱ组比较有显著差异(P ＜0.05)(见表3)。

2.5 EMSA检测模型鼠海马内NF-κB的表达

NF-κB在模型Ⅰ组海马内表达增加，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05);模型Ⅱ组中NF-κB的表达增加，与对照组比和模型Ⅰ组比较均有显著性差异(P ＜0.05)。

2.6 IHC观察模型鼠海马内NF-κB p65的表达 对照组少见 NF-κB p65表达强阳性细胞，且NF-κB p65在细胞核内少有表达。模型Ⅰ组内NF-κB p65表达增加，且阳性细胞较集中分布，可见NF-κB p65由胞浆向细胞核内转移;模型Ⅱ组中NF-κB p65的表达增加和核内转移更为明显。于高倍镜下计数阳性细胞数并计算阳性率，模型Ⅰ组和模型Ⅱ组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，模型Ⅰ组与模型Ⅱ组比较有显著性差异(P＜0.05)。

表1 各组模型鼠癫痫发作及死亡情况

表2 各模型组与对照组海马各区神经元数目(χ±s)

表3 对照组与模型组海马DG区内分子层MFS评分(χ±s)

3 讨论

作为最常见的癫痫亚型，MTLE被认为是因高热惊厥、癫痫持续状态、脑炎、肿瘤、外伤等引发的继发性功能改变所致，并且存在5～10年甚至更长的潜伏期，继而形成慢性自发癫痫［4］，目前对于该病的治疗主要还是通过药物或其他生物方法控制癫痫的发作，以减少惊厥给大脑造成的损害，而针对病因的治疗甚少，这主要是由于该病作用机制尚不明了。

炎症是最常见且重要的基本病理过程，早前观点认为由于血脑屏障的存在，大脑成为了免疫豁免场所，炎症反应是不参与癫痫发生发展的，但是近年来越来越多的研究发现，炎症反应在癫痫的发生发展中起了重要的作用［5］。而作为前炎症因子的IL-1β被认为与癫痫的发生有密切的相关性。有报道IL-1β途径参与了癫痫的发病过程［6］，IL-1β甚至被认为是热性惊厥致颞叶癫痫海马硬化的启动因子［7］。Zheng等［8］亦报道小胶质细胞能通过分泌IL-1β促进海马神经元的活化。我们早先的研究［9］也发现，在匹罗卡品致痫的MTLE模型中，模型鼠海马内的IL-1β在急性期和慢性期表达增加。这都提示IL-1β可能对癫痫的发生发展起促进作用。但也有报道认为IL-1β在对神经发生存在负性调控，如IL-1β可以抑制神经发生并减少惊厥所致的神经变性［10，11］;而腹腔或侧脑室注射小剂量的 IL-1β 似乎能起到抗癫痫的作用［12，13］。由此可见IL-1β在癫痫病理过程中的作用机制复杂，正性及负性的调控均存在于病理过程之中。本实验中我们观察到，大鼠致痫后再注射IL-1β可以加重实验鼠在急性期的痫性发作，模型Ⅱ组大鼠较模型Ⅰ组表现得更为焦躁、攻击性强，并且这种状态持续时间以及急性期反复的惊厥发作次数均较模型Ⅰ组明显。进入慢性癫痫自发发作期后，模型Ⅱ组的癫痫自发发生率较模型Ⅰ组高(P＞0.05)，脑电图改变更加明显，这说明IL-1β可以加剧模型鼠的痫性发作，并促进慢性期MTLE模型的发病。进一步利用Nissl染色和Timm染色观察到，模型Ⅱ组神经元脱失和苔藓样出芽均较模型Ⅰ组改变明显，这提示，IL-1β在促进模型鼠自发癫痫的过程中伴随有大量海马神经元的死亡，并且导致了Mossy纤维的大量增生，这正是神经元异常放电和癫痫慢性自发发作的病理基础。

NF-κB体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递，是免疫反应及炎症应答的关键调节因子。NF-κB在细胞内受到多种物质调控，如IL-1β、TNF-α、IL-2等，而NF-κB活化后，亦可增强前述各物质的基因转录，使其释放增多，从而导致炎症信号的进一步放大。此外在癫痫的神经病理发作过程中，亦观察到NF-κB起着重要调节作用。诸多研究发现NF-κB在惊厥发作及癫痫慢性自发发作过程中均表达增加［3］，而向癫痫模型鼠体内注射NF-κB抑制剂PDTC可以减少模型鼠的惊厥发作［14］，这提示 NF-κB可能是MTLE发生中的关键通路之一。实验中，我们也证实模型Ⅰ组海马内NF-κB表达增加，并且观察到最具代表性的活性亚基NF-κB p65出现明显的核内转移，这说明NF-κB可能是匹罗卡品诱导的MTLE的疾病发生和进展的重要环节。既然NF-κB与炎症和癫痫病理均存在着密切关系，那么NF-κB是否能够作为一个契合点在炎症与癫痫的发生过程中起到桥梁的作用呢?目前关于神经系统病变中IL-1β与 NF-κB的关系研究存在不同报道，有研究［15］认为 IL-1β 作为 NF-κB 的上游炎症因子，通过IL-1RI调节NF-κB的核转录，进而影响神经发生、促进炎症反应、导致星形胶质细胞功能障碍等。Pitkanen［16］等亦报道 IL-1β 通过激活 MAPK 及 NF-κB依赖途径对癫痫病理过程进行分子改变、离子通道等的调节。同样也有研究认为［17］TNF-α、IL-1β、GMCSF等的调节均通过NF-κB途径。而我们通过向致痫模型海马内注射IL-1β可以观察到，模型Ⅱ组大鼠海马内NF-κB的表达较模型Ⅰ组更加明显，结合行为学观察以及神经元改变程度，我们有理由认为IL-1β可以通过活化NF-κB并增加其表达，进而促进MTLE大鼠模型慢性期的癫痫自发发作。

综上所述，增加海马内IL-1β的表达，可以使匹罗卡品诱导的MTLE模型鼠海马癫痫慢性自发发作率增加，这可能与IL-1β通过促进NF-κB活化和表达，从而促进神经元脱失和Mossy纤维增生，最终导致神经元异常放电和癫痫慢性自发有关。而炎症与癫痫病理、IL-1β与NF-κB在此过程中的相关性还有待进一步的动物模型及体外研究，对这一问题的深入研究，可能为MTLE的防治提供新的思路。

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